Les milieux de culture minéraux et organiques ont une structure communautaire, une stabilité et une fonctionnalité distinctes dans les systèmes de culture hors-sol

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 18837 (2016) Citer cet article

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Le choix d'un milieu de culture hors-sol pour la nutrition, la croissance et le soutien des plantes est crucial pour améliorer l'éco-durabilité de la production dans les systèmes horticoles. Comme notre compréhension actuelle des communautés microbiennes fonctionnelles habitant cet écosystème est encore limitée, nous avons examiné le développement de la communauté microbienne des deux milieux de culture les plus importants (organique et minéral) utilisés dans les systèmes horticoles ouverts hors-sol. Nous avons cherché à identifier les facteurs qui influencent la composition de la communauté au fil du temps et à comparer la distribution des taxons individuels dans les milieux de culture et leur fonctionnalité potentielle. L'analyse de séquençage à haut débit a révélé une communauté microbienne distincte et stable dans le milieu de culture biologique. L'humidité, le pH, le nitrate-N, l'ammonium-N et la conductivité ont été découverts comme les principaux facteurs associés aux communautés bactériennes résidentes. L'ammonium-N était corrélé à l'abondance des Rhizobiaceae, tandis que des interactions compétitives potentielles entre les Methylophilaceae et les Actinobacteridae avec les Rhizobiaceae ont été suggérées. Nos résultats ont révélé que les milieux de culture hors-sol sont des niches uniques pour diverses communautés bactériennes avec une stabilité fonctionnelle temporelle, ce qui peut éventuellement avoir un impact sur la résistance aux forces externes. Ces différences dans les communautés peuvent être utilisées pour développer des stratégies pour évoluer vers une horticulture durable avec une productivité et une qualité accrues.

Aux États-Unis, au Canada et en Europe, 95 % des légumes de serre, en particulier les tomates, sont produits dans des systèmes de culture de plantes en serre hors-sol utilisant des milieux de culture horticoles1. Les systèmes horticoles ouverts hors-sol présentent des avantages par rapport aux systèmes traditionnels en ce sens que les nutriments, l'oxygène et l'eau nécessaires à une croissance saine des plantes sont contrôlés2 et que les agents pathogènes transmis par le sol peuvent être contournés3,4. En Europe de l'Ouest, la quasi-totalité des tomates cultivées en serre sont produites sur un substrat de culture minéral constitué de fibres synthétiques inorganiques5. Les milieux de culture minéraux sont produits à partir de diabase, de calcaire et de cokes, qui sont fondus ensemble à 1500 °C et filés en fibres6. En revanche, la tourbe et la noix de coco sont les constituants d'origine organique les plus utilisés des milieux de culture produits dans l'UE7. Alors que le substrat de culture minéral a un pH neutre, une forte teneur en air et une faible densité, le substrat de culture organique se caractérise par sa forte teneur en matière organique et sa capacité d'échange cationique avec la solution aqueuse irriguant le substrat de culture. Malgré ces différences, le rendement et le nombre de fruits de tomate (Solanum lycopersicum) étaient comparables parmi les plantes cultivées sur des milieux de culture minéraux ou organiques pendant plusieurs années consécutives8.

La durabilité des systèmes de serre hors-sol dépend fortement de l'augmentation des rendements et de l'efficacité générale du processus de culture4. Des mesures de désinfection sont prises en serre pour garantir le rendement final et la qualité4. Cependant, cela entraîne l'élimination non seulement des micro-organismes délétères mais également des taxons microbiens potentiellement bénéfiques pour la plante. Cela peut finalement empêcher la communauté d'atteindre l'équilibre et la stabilité, rendant ces systèmes de culture hors-sol à risque d'invasion réussie d'agents pathogènes4. La biodiversité protège les écosystèmes contre le déclin de leur fonctionnalité, conséquence de la redondance fonctionnelle due à la coexistence de plusieurs espèces9,10. Cela peut également conduire à une productivité accrue11, en raison de l'impact positif sur la respiration bactérienne, la production de biomasse microbienne et le stockage des éléments nutritifs des plantes. En outre, une stabilité fonctionnelle temporelle accrue et une résistance aux forces externes, telles que les perturbations des nutriments et les espèces envahissantes, ont été signalées10,12.

La communauté microbienne complexe associée aux plantes, également appelée « deuxième génome de la plante », est cruciale pour la santé, la croissance et le développement des plantes13. Les travaux antérieurs portant sur les communautés microbiennes associées aux milieux de culture se sont principalement concentrés sur l'absence de bactéries et de champignons pathogènes14. Il y a une compréhension limitée des facteurs qui influencent la composition de la communauté au fil du temps, la distribution des taxons individuels dans les milieux de culture et leur fonctionnalité potentielle. Le manque de stratégies de contrôle efficaces visant à améliorer la productivité15 augmente notre besoin de surveiller de près la rhizosphère, le milieu de culture et ses populations microbiennes.

Dans cette étude, nous avons examiné le développement de la communauté microbienne des deux milieux de culture les plus importants utilisés dans les systèmes horticoles hors-sol ouverts : organique (GB) et minéral (RW). Nous avons émis l'hypothèse que les milieux de culture RW et GB développent une structure communautaire différente avec des fonctionnalités potentiellement uniques. Une grande partie de la fluctuation dans la rhizosphère est définie par la racine de la plante et les conditions du milieu de culture. Par conséquent, la rhizosphère et la communauté microbienne associée au milieu de culture sont fortement liées. Les connaissances concernant ces différences peuvent être utilisées pour développer des stratégies vers une horticulture durable, avec une productivité et une qualité améliorées et une résistance potentiellement accrue aux forces externes12. Le syndrome des racines velues causé par une infection à Agrobacterium rhizogenes est un problème majeur en horticulture sous serre, car le rendement total peut diminuer jusqu'à 10 % dans les plants de tomates16. Dans notre étude, une infection naturelle par A. rhizogenes a été détectée dans certaines plantes poussant dans le milieu RW (RWS). Les interactions se produisant entre les racines, la rhizosphère et le support de culture et la résistance potentielle aux forces extérieures, représentées dans notre étude par A. rhizogenes, ont également été évaluées.

Les Chitinophagaceae, les Xanthomonadaceae, les Flavobacteriaceae, les Hypomicrobiaceae, les Microbacteriaceae, les Comamonadaceae, les Enterobacteriaceae, les Methylophilaceae, les Rhizobiaceae, les Pseudomonadaceae et les Sphingobacteriaceae étaient les familles bactériennes les plus abondantes dans les deux milieux de culture (Fig. 1A). Les chitinophagacées, les méthylophilacées et les hypomicrobiacées étaient abondantes en GB, tandis que les microbactéries étaient plus nombreuses en RW. Les Enterobacteriaceae, Verrucomicrobiaceae et Rhizobiaceae étaient abondantes dans RWS et diminuées dans GB (tableaux 1 et 2). L'analyse multivariée permutationnelle de la variance (PERMANOVA) a confirmé que le type de milieu de culture, mais pas le moment, contribuait de manière significative aux différences d'abondance relative des familles bactériennes (P <0, 05, Fig. 1B). L'analyse des profils DGGE a montré que les échantillons RWS se regroupaient indépendamment du temps, tandis que le reste des échantillons avait tendance à se regrouper en fonction du moment (Fig. 1 supplémentaire). Le nombre total d'espèces était plus élevé en GB (P <0,05), tandis que la diversité et la régularité entre GB et RW étaient significativement différentes d'un point de temps à l'autre (P <0,05, tableau supplémentaire 1). RW et RWS ont montré des similitudes constantes dans leurs mesures de diversité et d'uniformité (tableau supplémentaire 2).

(A) Abondances relatives des familles bactériennes présentes dans les milieux de culture horticoles. Les familles avec le nombre de séquences le plus élevé et leur classification RDP correspondante sont indiquées. RW : milieu de culture minéral ; GB : substrat de culture biologique, RWS : substrat minéral à racines poilues. L'ensemble de données a été raréfié au plus petit nombre de séquences ; les abondances relatives ont été calculées en additionnant le nombre d'UTO appartenant à la même famille. (B) La structure de la communauté était significativement différente entre les types de supports de culture. Une analyse de l'homogénéité multivariée des dispersions de groupe (variances) a été réalisée et une analyse de mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique a été utilisée pour évaluer la similitude entre les communautés bactériennes. Les symboles indiquent le type de milieu de culture : cercles, milieu de culture biologique (GB) ; triangles, substrat de culture minéral (RW); carrés, substrat de culture minéral à racines poilues (RWS). Le nombre dans la légende spécifie le point dans le temps et la lettre fait référence à la répétition de l'échantillon. Par exemple, "GB1A" fait référence à la réplique "A" du milieu de culture biologique, collectée au premier moment.

L'analyse factorielle multiple (MFA) a montré que les familles associées à GB étaient représentées dans la dimension 1 (P <0, 0001, Fig. 2A), représentant 28% de la variance des abondances relatives parmi tous les échantillons. Gemmatimonadaceae, Sinobacteraceae, Sorangiineae, Opitutaceae, Desulfobacteraceae, Actinobacteridae, Hahellaceae, Gaiellaceae, Hypomicrobiaceae, Methylophilaceae, Acetobacteraceae, Methylocystaceae, Conexibacteriaceae, Xanthobacteraceae et Nitrospira non classé étaient significativement associés à GB. Les familles bactériennes corrélées avec RW étaient représentées dans Dim. 3 (P < 0,05) et explique 11 % de la variance totale. Pseudonocardineae, Propionibacterineae, Bacteroidaceae, Commamonadaceae, Incertae Rhizobiales et Cryomorphaceae ont été associées à cette dimension. Rhizobiaceae, Verrucomicrobiaceae, Planctomycetaceae, Simkaniaceae, Piscirickettsiaceae et Caldilineaceae étaient des familles associées à RWS et incluses dans Dim. 5 (P < 0,05, tableau supplémentaire 3).

(A) Variations de l'abondance des familles bactériennes dans les milieux de culture horticoles. Selon le cercle de corrélation, les familles appartenant à la première composante de l'Analyse Factorielle Multiple (Dim. 1) sont négativement corrélées à l'abondance des espèces appartenant aux Rhizobiaceae (23). Puisqu'il y a plus de familles dans Dim 3., leur contribution à la variance globale entre les échantillons est plus faible. La dimension 3 décrivait les familles significativement corrélées avec RW (P < 0,05). 1, Propionibacterineae; 2, Pseudonocardinées ; 3, Rhodobactéries ; 4, Caedibacter; 5, Incertae Rhizobiales; 6, Nitrospira non classé ; 7, Méthylophilacées; 8, Gaiellacées ; 9, Acétobactéries; 10, Actinobacteridae; 11, Xanthobactéries; 12, Hahellacées ; 13, Sinobacteraceae; 14, Désulfobactéries; 15, Hyphomicrobiacées ; 16, Opitutacées ; 17, Gemmatimonadacées; 18, Méthylocystacées ; 19, Sorangineae ; 20, Hyophomonadacées; 21, Chromatiaceae ; 22, Rhodocyclacées ; 23, Rhizobiacées. (B) La carte d'analyse factorielle multiple a indiqué que les échantillons de milieu de culture organique (GB) affichaient des abondances similaires à travers les points dans le temps et différaient de ceux du milieu minéral (RW). L'abondance des familles bactériennes dans les échantillons de RW à racines velues (RWS) était similaire à celle de RW. Des symboles indiquent le type de substrat de culture : cercles noirs pour GB, triangles gris pour RW et carrés blancs pour RWS. Le nombre dans la légende spécifie le point dans le temps et la lettre fait référence à la répétition de l'échantillon. Par exemple, le cercle étiqueté "1A" fait référence à la réplique "A" de GB, collectée au premier moment.

Le test de Tukey pour les comparaisons par paires des dispersions moyennes de groupe a été effectué à l'aide du package végétalien dans R. Comme le démontrent les mesures de diversité et d'uniformité (tableaux supplémentaires 1 et 2), l'interaction entre le temps et le type de milieu de culture était significative au troisième moment ( P < 0,05). Sur la base des abondances relatives des familles bactériennes et des mesures de diversité alpha et d'uniformité, nous avons validé la présence de communautés microbiennes distinctes et stables associées à chaque milieu de culture (tableaux 1 et 2 et figure 2B).

Le rendement des plantes a été déterminé à la fin de la saison de croissance pour le milieu de culture organique et minéral et a donné un rendement cumulé total (poids frais) de 59,27 ± 1,52 kg.m−2 et 61,59 ± 0,86 kg.m−2 respectivement. Le calcium, le magnésium, le sulfate, le nitrate-N, le sodium et la conductivité étaient plus élevés en GB que le calcium, le magnésium, le sulfate, le nitrate-N, le sodium et la conductivité étaient plus élevés en GB qu'en RW (P < 0,05). en RW (P <0,05), tandis que l'ammonium-N, le potassium, le fer et le manganèse étaient significativement plus élevés en RW par rapport à GB (P <0,05, tableau supplémentaire 4). L'ammonium-N, le pH, la conductivité, le potassium, le sodium, le fer et le chlorure étaient les plus élevés en RWS (P <0,05, tableau supplémentaire 5). Des corrélations positives entre la conductivité et le nitrate-N ont été systématiquement détectées en GB, tandis que l'ammonium-N n'était associé à l'UFC totale qu'au troisième moment (P <0, 05, tableau 3). Dans RW, le pH était positivement corrélé avec Agrobacterium sp. UFC, tandis que la conductivité, l'ammonium-N, les sulfates et le sodium étaient corrélés négativement avec les UFC totales. Seuls les sulfates étaient positivement corrélés avec le sodium à travers les points dans le temps (P < 0,05, tableau 4). Des corrélations positives entre le calcium et Agrobacterium sp. et les UFC totales ont été trouvées dans RWS à tout moment (P <0, 05, tableau 5). En revanche, l'humidité était corrélée négativement avec Agrobacterium sp. et UFC totale lorsque les racines poilues ont été détectées pour la première fois (P < 0,05). L'objectif de l'AMF était double : discriminer les milieux de culture en fonction des variables mesurées et découvrir les corrélations entre les caractéristiques physicochimiques et biologiques au sein du milieu de culture. En général, l'AMF a montré que les bactéries totales, Agrobacterium sp. L'UFC, l'humidité, le pH, le sulfate et la conductivité étaient les traits qui contribuaient le plus à la variance totale entre les échantillons (Fig. 3A). Ammonium-N et Agrobacterium sp. Les UFC étaient les deux variables les plus corrélées à la dimension 1 (P < 0,0001, tableau supplémentaire 6), qui représentaient 29,8 % de la variance. Les ratios de corrélation au carré mesurent le degré d'association entre les variables et un axe particulier. Ainsi, le cos2 entre les coordonnées des échantillons et le type de milieu de culture a révélé que ce qui précède étaient les principales caractéristiques décrivant le milieu RWS sur Dim. 1 (cos2 > 0,5). Faible. 2 (26,7 % de la variance totale) a été construit par les caractéristiques de GB (sulfate, conductivité, sodium, magnésium, calcium et nitrate-N), tandis que le potassium, le manganèse, le fer et l'humidité ont été inclus dans Dim. 3 avec RW (P < 0,05, 13,6 % de la variance). Nous avons confirmé que chaque milieu de culture était caractérisé par un ensemble unique de variables physico-chimiques et biologiques, qui se conserve dans le temps (Fig. 3B).

Les caractéristiques physiques et chimiques du milieu de culture sont uniques pour chaque environnement.

(A) Analyse factorielle multiple des caractéristiques physiques et chimiques des milieux de culture horticoles. Le cercle de corrélation indique la contribution des variables à l'origine des différences entre les milieux de culture. Les vecteurs longs dans la même direction indiquent des corrélations positives entre les variables, tandis que les vecteurs longs dans la direction opposée indiquent des corrélations négatives. (B) L'analyse factorielle multiple a mis en évidence les similitudes entre les échantillons de milieux de culture au fil du temps, en fonction de leurs caractéristiques physiques et chimiques. Des symboles indiquent le type de substrat de culture : cercles noirs pour GB, triangles gris pour RW et carrés blancs pour RWS. Le nombre dans la légende spécifie le point dans le temps et la lettre fait référence à la répétition de l'échantillon. Par exemple, le cercle étiqueté "1A" fait référence à la réplique "A" de GB, collectée au premier moment.

Au lieu de calculer les coefficients de corrélation de Pearson entre chaque paire de variables, les réseaux bipartites ont été déduits à l'aide d'une matrice de similarité par paire obtenue à partir de l'analyse de corrélation canonique régularisée (Fig. 4). Les valeurs de la matrice de similarité ont été calculées comme la corrélation entre les abondances relatives des familles bactériennes et les caractéristiques du milieu de culture projetées sur l'espace couvert par les premiers composants retenus dans l'analyse. Trois composantes pertinentes ont été obtenues en fixant un seuil à 0,5. De cette façon, l'ammonium-N a été corrélé avec l'abondance des Rhizobiaceae. Les familles associées au RW étaient corrélées au fer (P < 0,05), tandis que le potassium, le magnésium, le calcium et les nitrates étaient associés au GB (P < 0,05). L'analyse des correspondances (CA, Fig. 2 supplémentaire) a été utilisée pour révéler l'association entre le milieu de culture (rangées) et les variables physicochimiques et les abondances relatives (colonnes). La statistique du chi carré a indiqué un lien étroit entre le milieu de culture et les variables physicochimiques et les abondances relatives (P < 0,05). Les coordonnées des variables ligne/colonne représentent le nombre d'écarts types entre les variables ligne/colonne et le barycentre17. Par conséquent, les coordonnées les plus élevées dans Dim.1 appartenaient à Agrobacterium sp. CFU, Solimonadaceae, Ammonia-N et P (lignes) et RWS et point temporel 3 (colonnes), qui expliquent tous 92,9 % de la variance. Faible. 2 était motivée par les relations entre les familles les plus abondantes détectées en GB au point 2. Les interactions observées ont confirmé les résultats des analyses de corrélation précédentes (tableaux 1 et 2).

Graphique en réseau basé sur les corrélations canoniques régularisées entre l'abondance de la famille bactérienne et les caractéristiques physico-chimiques du support de culture.

Les corrélations (r) ont été filtrées pour une corrélation absolue supérieure à 0,5 et sont colorées selon la clé indiquée. Selon l'algorithme graphique, les corrélations les plus fortes sont les lignées plus courtes et les familles avec des abondances similaires dans le milieu de culture ont tendance à se regrouper étroitement. Cette représentation révèle la relation entre des grappes de familles liées aux différentes caractéristiques physiques et chimiques de l'environnement, révélant ainsi potentiellement des populations spécifiques au milieu de croissance. En vert, familles bactériennes corrélées avec RW ; en rouge, les familles bactériennes associées au RWS, en violet, les familles corrélées au GB.

La courbe de rétention d'eau des deux milieux de culture a été déterminée. La teneur en eau volumétrique saturée de RW (θs = 0,9834) était en accord avec les rapports précédents de Wallach18, tandis que la teneur en eau volumétrique saturée de GB était θs = 0,935. La teneur en eau volumétrique (θv = 85,3 %) de RW correspond à un potentiel matriciel de −0,6 kPa, alors que θv = 83,1 % pour RWS correspond à un potentiel matriciel de −0,61 kPa. Pour le substrat de culture organique, θv = 81,93 % représente un potentiel matriciel de −0,46 kPa.

Sept échantillons RW (46,7 % sur quinze) étaient positifs pour A. rhizogenes biovar 2, tandis que les échantillons de GB étaient négatifs pour l'une des espèces testées d'Agrobacterium sp. (Tableau complémentaire 7). Agrobacterium phytopathogène sp. Les souches hébergent les gènes nécessaires au processus et au transfert de l'ADN-T dans les régions de virulence (virC) des plasmides inducteurs de racine (pRi)19,20. Par conséquent, les échantillons RW positifs pour A. rhizogenes biovar 2 et tous les échantillons RWS ont été testés pour la présence du gène de pathogénicité virC et tous les RWS ont été testés positifs. Les comptages sur plaque sur le milieu sélectif ont confirmé les résultats de la PCR multiplex. Les résultats de la PCR de colonie dans des isolats de type sauvage sélectionnés au hasard ont validé la présence du gène virC et de A. rhizogenes biovar 2 dans RWS (tableau supplémentaire 7). Différences dans Agrobacterium. sp. Les UFC entre les milieux de culture étaient influencées par le temps et étaient plus faibles dans RW par rapport à RWS (P <0, 05, tableau supplémentaire 7).

Sur la base des abondances relatives des familles associées à chaque milieu de culture, nous avons validé la présence d'une structure de communauté microbienne compétitive, distinctive et stable dans le milieu de culture biologique. De plus, nous avons identifié l'humidité, la teneur en potassium, le pH et la conductivité comme les principales caractéristiques physicochimiques à l'origine des communautés microbiennes dans le milieu de culture.

Le séquençage à haut débit combiné à des techniques moléculaires a permis de découvrir la structure du microbiote associé au milieu de culture. GB abritait une plus grande diversité bactérienne que RW et RWS. De plus, GB a affiché des abondances similaires de familles bactériennes à travers les moments, tandis que RW et RWS ont affiché une plus grande variabilité. Ces différences pourraient être associées à la structure et à la composition différentes des deux types de milieu de culture, qui peuvent fournir des niches uniques pour la communauté microbienne21. La densité et la biodiversité de la communauté microbienne peuvent être affectées par l'âge du support de culture22. La biodiversité dans les systèmes hors-sol avec des milieux de culture minéraux est faible au début d'une culture4, puis elle augmente en quelques semaines23, atteignant une stabilité après six semaines de croissance des plantes24. Comme décrit dans des rapports précédents21, notre milieu RW non cultivé a montré de faibles quantités de nutriments et de bactéries totales UFC (<102 UFC g-1) par rapport à GB (2,2 × 107 UFC g-1). La quantification du nombre de cellules viables (CFU) de la microflore aérobie cultivable colonisant différentes parties du système, telles que la zone racinaire, la solution nutritive, les milieux de culture et les dispositifs du système (tubes, gouttières, etc.), a été réalisée25. Cependant, seuls 1 à 10 % de la microflore peuvent être récupérés à partir de techniques basées sur une culture en plaque sur gélose R2A, fournissant des informations limitées sur l'ensemble de la communauté présente sur chaque milieu de culture. Pour cette raison, nous avons complété les études de culture par une caractérisation moléculaire des communautés microbiennes.

L'augmentation de la biodiversité microbienne observée dans le milieu de culture peut être attribuée à l'activité des plantes. Les plantes exsudent jusqu'à 21 % de leur carbone fixé par photosynthèse dans l'interface racine-sol26, nourrissant les communautés microbiennes et influençant leur activité et leur diversité14. Berendsen et al.27 ont suggéré que les espèces végétales peuvent sélectionner des bactéries par la production d'exsudats racinaires spécifiques et ainsi façonner le microbiome de la plante. Nous avons utilisé des aubergines greffées sur un porte-greffe de tomate connu pour sa grande capacité d'exsudation (Solanum lycopersicum L. x Solanum habrochaites). L'exsudation racinaire dans les deux milieux de culture a été estimée similaire, car les aubergines cultivées ont montré des caractéristiques de croissance et de rendement comparables. Nous avons constaté que même après six mois, la communauté microbienne dans le milieu de culture minéral (à la fois dans RW et RWS) présentait une grande variabilité dans le temps. Garbeva et al.28 ont émis l'hypothèse que dans un système stable, chaque microhabitat est occupé par des organismes capables de coloniser des niches. Un écosystème diversifié et stable au niveau du microhabitat résistera aux stress environnementaux29 et potentiellement à l'invasion d'agents pathogènes. Mendes et al.14 ont suggéré que l'abondance relative de plusieurs taxons bactériens pourrait être un indicateur de la suppression de la maladie. De cette manière, une résistance accrue à l'invasion de pathogènes peut être liée à la biomasse microbienne totale dans le milieu de culture, qui entre en compétition avec les pathogènes pour les ressources ou peut provoquer une inhibition par antagonisme direct15. Mendes et al.14 ont identifié les actinobactéries, les γ- et β-protéobactéries (Pseudomonadaceae, Burkholderiaceae, Xanthomonadales) et les Firmicutes (Lactobacillaceae) comme les taxons les plus dynamiques associés à la suppression des maladies dans le sol naturel. Dans notre étude, les Rhodocyclaceae et les Methylophilaceae (β-Proteobacteria), étaient corrélées à GB, ainsi que d'autres α-, β et γ-Proteobacteria, telles que les Hyphomicrobiaceae, les Xanthobacteraceae, les Phyllobacteriaceae et les Chromatiaceae. Les actinobactéries telles que Gaiellaceae et Conexibacteraceae étaient également positivement corrélées avec GB. De plus, l'abondance de Rhizobiaceae (comme Agrobacterium sp.) était négativement corrélée à l'abondance de Methylophilaceae et de Saprospiraceae en GB. Ainsi, l'abondance relative de plusieurs taxons et la stabilité d'une communauté microbienne peuvent être liées à la résistance contre les envahisseurs externes, soutenant la théorie de la suppression générale. Même si Agrobacterium sp. a été détecté dans les deux milieux de culture (en moyenne 7,6 × 103 UFC/ml en GB, 2,4 × 104 en RW et 1,0 × 106 UFC/ml en RWS, à différents moments), les échantillons de GB étaient négatifs pour la présence de la pathogénicité virC gène. Ni les UFC totales ni la présence de taxons microbiens particuliers n'ont été directement associées à la résistance à Agrobacterium rhizogenes27.

La plante, ainsi que les interactions biologiques, chimiques et physiques complexes dans le milieu de culture influencent les communautés microbiennes de la rhizosphère. Des rapports antérieurs ont identifié le pH comme le principal moteur des communautés microbiennes dans le sol30. L'humidité du sol est souvent associée au pH et peut avoir eu un impact sur la composition de la communauté entre GB, RW et RWS. De plus, GB a montré des abondances relatives plus élevées d'Actinobacteridae et d'α-Proteobacteria, qui ont été associées à un pH30 du sol. La mobilité des rhizobactéries peut être limitée par l'humidité du milieu de culture, où les pores remplis d'eau peuvent être aussi grands que les cellules bactériennes31. Bien qu'Agrobacterium sp. a été détecté en GB et RW, les racines poilues n'étaient pas visuellement présentes en GB. Nos résultats indiquent que les différences de taille des pores et de distribution de l'eau entre GB et RW peuvent avoir eu un impact sur la mobilité d'Agrobacterium sp., entraînant une diminution de l'incidence de la maladie. Des rendements élevés de racines poilues indiquant une invasion par A. rhizogenes ont été observés lorsque le rapport nitrate-ammonium (NO3−-N/NH4+) était proche de 5 avec 115 mg NH4+-N/l de sol et 553 mg NO3-−N/l du sol32. Dans notre test, le rapport NO3−-N/NH4+-N était de 2,3 pour RWS, 31,9 pour RW et 147,3 pour GB. La faible concentration d'ammoniac et le faible pH dans le milieu GB peuvent expliquer l'absence de racines poilues33 et potentiellement façonner la composition de la communauté microbienne.

Notre méthodologie a fourni un aperçu complet des interactions bactériennes complexes dans les milieux horticoles, soutenant notre hypothèse selon laquelle il existe des différences fondamentales entre les communautés bactériennes associées à chaque type de milieu de culture horticole. Des communautés microbiennes diverses et compétitives peuvent fournir des fonctionnalités différentes et uniques. En conséquence, la communauté bactérienne habitant le milieu GB peut avoir fourni une diversité fonctionnelle et une stabilité temporelle et une résilience à cet environnement hétérogène et fluctuant. En fin de compte, les interactions au sein de la communauté résidente peuvent également jouer un rôle dans la résistance aux forces externes, telles que les espèces envahissantes en compétition dans les systèmes de culture hors-sol conventionnels. Les futures stratégies de contrôle alternatives peuvent impliquer l'évaluation de la capacité de suppression des groupes microbiens et le transfert de la capacité de suppression à des sols propices avec 0,1 à 10 % de sol suppressif15. Les relations décrites contribueront également à la compréhension de l'écologie microbienne fonctionnelle associée au milieu de culture et à l'interaction entre la communauté microbienne et les plantes. Les connaissances concernant ces relations pourraient potentiellement être utilisées pour développer des stratégies durables pour augmenter la productivité et la qualité des plantes.

La communauté microbienne associée aux différents supports de culture a été suivie dans une serre commerciale de 8,5 ha aux Pays-Bas (51°59' Latitude et 4°10′ Longitude), cultivant l'aubergine Solanum melongena cultivar Jaylo (Rijk Zwaan, Pays-Bas), greffée sur Solanum lycopersicum L. x Solanum habrochaites Beaufort (De Ruiter, Pays-Bas). Les deux milieux de culture horticoles différents ont été installés en même temps dans la serre et les aubergines de 48 jours ont été plantées sur les deux milieux de culture différents le même jour. Le milieu de culture biologique (GB, Grow Bag, Peltracom, Belgique) était un mélange de tourbe blanche (H2-H4 sur l'échelle de von Post34 [80 % v/v] et de fibre de coco [20 % v/v]). Les dalles de GB et de milieu minéral (RW, laine de roche, expert Grotop, Grodan, Pays-Bas) avaient les dimensions suivantes : 1,0 m × 0,2 m × 0,085 m et 1,0 m × 0,2 m × 0,075 m, respectivement. Les deux supports de culture ont été soumis à des traitements d'eau et d'engrais identiques pendant la période de culture selon des méthodes standard, avec une solution de fertirrigation standard21. Deux aubergines par dalle ont été plantées. Chaque plante a été palissée à 3 tiges, visant une densité de plantes de 1,7 plantes/m2 résultant en 5,1 tiges/m2.

La serre a été divisée en plusieurs blocs composés chacun de 6 rangées dans une conception en blocs aléatoires. Deux blocs contigus ont été choisis au hasard et chaque bloc contenait du milieu RW ou GB. Les deux rangées extérieures de chaque bloc n'ont pas été sélectionnées, en raison d'interactions possibles avec les rangées adjacentes. Les aubergines poussaient en plaques placées consécutivement avec un espacement de 44 cm. Une dalle a été considérée comme une unité expérimentale. Cinq dalles de chaque bloc ont été sélectionnées au hasard dans les 4 rangées intérieures et dans les deux milieux de culture différents (GB et RW). Des échantillons des différentes unités expérimentales ont été prélevés à trois moments de la saison de croissance (juin, juillet et août) et au début de l'expérience. Dix sous-échantillons de chaque unité expérimentale ont été collectés, regroupés, homogénéisés et traités comme un seul échantillon (Fig. 3 supplémentaire). À chaque instant, des échantillons ont été prélevés dans 5 unités expérimentales fixes de chaque RW et GB, y compris le matériel racinaire. Chaque échantillon de 200 g a été divisé en 4 sous-échantillons homogènes de 50 g pour une analyse plus approfondie : deux sous-échantillons (sous-échantillons 1 et 2) ont été utilisés pour les analyses chimiques, un sous-échantillon (sous-échantillon 3) a été stocké à 4 °C et utilisé pour l'isolement et l'identification. d'Agrobacterium sp. et les UFC totales, ainsi que la détermination de l'humidité et le sous-échantillon 4 ont été immédiatement stockés sur de la neige carbonique, conservés à -80 ° C et utilisés pour l'analyse moléculaire de la communauté microbienne. Le producteur a signalé la présence antérieure du syndrome des racines velues, causé par le pathogène Agrobacterium rhizogenes. Par conséquent, l'incidence de la maladie du syndrome des racines velues a été suivie par une inspection visuelle mensuelle de la serre. Le syndrome des racines poilues a été détecté dans une dalle RW au premier moment en juin. Une inspection visuelle plus poussée en juillet et en août a révélé une incidence accrue du syndrome des racines poilues dans le milieu RW. Des échantillons supplémentaires de RW provenant de 5 dalles supplémentaires présentant des symptômes visuels du syndrome des racines velues ont été prélevés (appelés RWS). Cependant, aucune racine poilue n'a été identifiée visuellement dans le GB pendant toute la période expérimentale (décembre 2012 et novembre 2013).

Les caractéristiques physico-chimiques des différents supports de culture ont été déterminées au début (décembre 2012) et au cours de la saison de végétation (juin, juillet et août 2013). L'analyse chimique a été effectuée comme décrit par Gabriels, et al.35. L'humidité (w/w-%) du support de culture a été déterminée selon Verdonck et Gabriels36.

La courbe de rétention en eau du sol des milieux RW et GB a été établie à l'aide de l'appareil à bac à sable37 pour des potentiels de pression compris entre -1 et -10 kPa. Pour cette expérience, 10 répétitions des échantillons de dalle ont été utilisées. Les paramètres de l'équation de van Genuchten ont été estimés et les données ajustées38.

Le milieu de culture a été analysé dans les 48 heures suivant le prélèvement de l'échantillon. Cinq grammes du milieu de culture frais ont été mélangés avec 45 ml de NaCl39 à 0,85 % et homogénéisés pendant 2 minutes, en utilisant un mélangeur Stomacher 80 (Stomacher, Seward, Worthing, Royaume-Uni). Cette suspension a été utilisée pour la détermination de la cellule totale et d'Agrobacterium sp. compter sur chaque support. Pour le comptage cellulaire total, la suspension a été étalée sur gélose R2A (Sigma Aldrich, Diegem, Belgique) avec du cycloheximide (200 mg/l). Les colonies d'agrobactéries ont été sélectionnées et identifiées selon Shams et al.40. A. rhizogenes a été isolé en utilisant du 2E-Te contenant de l'érythritol et 320 mg/l de K2TeO3 avec du cycloheximide. Après 5 jours d'incubation à 28 ° C, les unités formant colonies (UFC) ont été comptées pour les milieux R2A et 2E-TE. Le calcul de l'UFC suivait les procédures décrites par Sutton41, où la limite de détection était égale à 1 UFC à la plus faible dilution.

L'ADN total a été extrait en utilisant une rupture physique avec la méthode de battement de billes de Hernandez-Sanabria, et al.42. Les cellules ont été lysées dans un homogénéisateur FastPrep-96 (MP Biomedicals, Illkirch, France) et l'ADN a été précipité avec de l'éthanol froid et remis en suspension dans 30 µl de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8,0]). La concentration et la qualité de l'ADN ont été mesurées sur la base de l'absorbance à 260 et 280 nm dans un spectrophotomètre Nanodrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).

La présence potentielle d'Agrobacterium sp. souches a été analysée par PCR multiplex, ciblant le gène de l'ARNr 23 S43. L'amorce sens universelle UF et quatre amorces antisens spécifiques de A. tumefaciens (biovar 1), A. rhizogenes (biovar 2), A. vitis et A. rubi ont été utilisées. Les conditions de la PCR ont été décrites ailleurs43 ; les paires d'amorces UF/B1R, UF/B2R, UF/AvR et UF/ArR ont été utilisées pour amplifier des fragments de 184, 1066, 478 et 1006 pb, respectivement44. La détection du plasmide pathogène a révélé la présence du gène de pathogénicité virC situé sur le plasmide rhizogène (Ri)45 ; Les conditions de PCR pour la détection du gène virC suivaient Kuzmanović et al.44. Une confirmation supplémentaire a été effectuée dans des isolats de type sauvage sélectionnés au hasard ; La PCR de colonie a été appliquée en utilisant le protocole décrit ci-dessus.

Des amplifications par PCR de la région V3 (~ 200 pb) du gène de l'ARNr 16 S des bactéries ont été réalisées avec des amorces bactériennes universelles comme décrit par Øvreås et al.46. Les produits de PCR ont été purifiés avant l'analyse des empreintes digitales et la DGGE a été exécutée sur un tampon 1 × TAE (AppliChem, Darmstadt, Allemagne) avec un gel de polyacrylamide à 6 % avec un gradient de dénaturation linéaire de 30 à 50 %, à l'aide du système universel de détection de mutation Bio-Rad DCode. (BioRad, Hercules, Californie, États-Unis). Les conditions de fonctionnement et l'analyse à l'aide du logiciel BioNumerics, version 5.1 (Applied Maths, Sint-Martens Latem, Belgique) ont été rapportées par Hernandez-Sanabria et al.42. De nouvelles catégories de bandes comprenant tous les phylotypes bactériens détectés sur les supports de culture ont été créées. La fréquence des phylotypes exclusivement présents dans les échantillons à racines velues a été déterminée en adaptant la méthodologie de Hernandez-Sanabria, et al.47, pour effectuer le test Fisher Exact dans R48.

La région V5-V6 du gène de l'ARNr 16S a été amplifiée à l'aide des amorces rapportées49. Les bibliothèques ont été préparées en regroupant des rapports équimolaires d'amplicons (200 ng de chaque échantillon), étiquetés avec un code-barres unique50. Les bibliothèques résultantes ont été séquencées sur un MiSeq (Illumina, Hayward, CA, USA) appariées et jointes, mais seules les lectures directes ont été sélectionnées pour l'analyse finale (140 nt). Un programme de filtre de qualité qui exécute une fenêtre glissante de 10 % de la longueur de lecture et calcule le score moyen local basé sur le score de qualité Phred du fichier FASTQ, a été utilisé pour couper les extrémités 3' des lectures qui sont tombées en dessous d'une qualité score de 10. Les lectures avec un caractère N dans leur séquence, les incompatibilités dans les amorces et les codes-barres ou plus de 8 tronçons d'homopolymères ont été rejetés. Après le découpage des séquences d'amorces, les séquences ont été séparées en fonction de leurs codes-barres. Un certain nombre de phylotypes représentatifs ont été générés à l'aide de l'algorithme Uclust sur USEARCH51 en regroupant à 97 % de similarité (1 incompatibilité), avec un niveau de confiance d'au moins 80, avec suppression des lignées de cyanobactéries, eucaryotes et archées. La base de données filtrée ne contenait que les phylotypes présents dans au moins a) un échantillon à une abondance supérieure à 1 %, b) dans 2 % des échantillons à une abondance relative supérieure à 0,1 % et 3) dans 5 % des échantillons à n'importe quel niveau d'abondance50. Par conséquent, un total de 475995 lectures ont été obtenues. La composition des séquences de l'ensemble de données a été comparée à l'aide de l'outil RDP Classifier tool52 et de la base de données SILVA53. Après avoir examiné le nombre de lectures, les données ont été raréfiées au hasard jusqu'à une profondeur maximale choisie de 17135 séquences, en utilisant le package phyloseq de R54 et les courbes de raréfaction ont été tracées à l'aide du package végétalien dans R55. Les abondances relatives des douze principaux taxons, avec leur classification RDP la plus profonde possible jusqu'au niveau de la famille, ont été déterminées et tracées sous forme de diagrammes à barres56. Si une OTU n'était pas classée jusqu'au niveau de la famille, la séquence consensus a été dynamitée à l'aide de la base de données NCBI et une classification taxonomique a été obtenue. Dans chaque échantillon, le nombre total d'espèces, la diversité de Fisher, les indices de Shannon, de Simpson et de Simpson inverse ont été calculés pour évaluer la diversité alpha. L'indice de Pielou a été utilisé comme indicateur de régularité dans la communauté. Les différences dans les mesures de diversité alpha et d'uniformité entre les milieux de culture horticoles ont été comparées à l'aide d'un modèle mixte à mesures répétées dans SAS (version 9.3, SAS Institute, Cary, États-Unis), avec le type de milieu de culture comme effet fixe et en comparant plusieurs moyennes à l'aide du test de Tukey. Par conséquent, les différences dans les mesures de diversité pourraient être attribuées au moment, au type de milieu de culture ou à l'interaction temps*type de milieu de culture. Les indices Chao et Bray-Curtis ont été utilisés pour construire des matrices de dissemblance des communautés. Par conséquent, la diversité bêta de la communauté a été déterminée et le nMDS a été utilisé pour visualiser les différences entre les échantillons, en utilisant le package végétalien dans R55. Une analyse multivariée permutationnelle stratifiée de la variance (PERMANOVA) avec 999 permutations a été menée pour explorer le pourcentage de variance pouvant être expliqué par les différences de diversité bêta. L'ANOVA a été appliquée pour découvrir si l'un des milieux de culture était plus variable que l'autre55. Les différences d'abondance relative des familles bactériennes ont été comparées à l'aide d'un modèle mixte à mesures répétées dans SAS, avec l'ajustement lsmeans et la correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples.

Les différences de caractéristiques physico-chimiques de chaque milieu de culture horticole ont été comparées à l'aide d'un modèle mixte en SAS. Les corrélations de Pearson ont été utilisées pour déterminer les interactions entre les caractéristiques physicochimiques et la signification a été supposée à P < 0,05. Seize variables ont été incluses dans l'analyse (humidité, pH, conductivité, nitrate-N, ammonium-N, phosphore, potassium, calcium, magnésium, sulfate, sodium, chlorure, fer, manganèse, UFC d'A. rhizogenes sp. et bactéries totales ). L'analyse factorielle multiple (MFA) a été utilisée pour détecter comment les abondances relatives des familles ont contribué aux différences entre les milieux de culture à travers les moments. De plus, l'AMF a été appliquée à l'ensemble des variables pour évaluer les corrélations entre les variables physiques, chimiques et microbiologiques détectées dans les deux types de substrat de culture. Chaque groupe de variables a été pondéré et les résultats ont été expliqués dans une carte factorielle57, où la valeur de l'abondance de chaque famille bactérienne (vecteur) pour le milieu de culture correspondant (facteur) a été tracée. La fonction MFA du package FactoMineR58 a été exécutée dans R. Les réseaux bipartites ont été déduits à l'aide d'une matrice de similarité par paires obtenue à partir de l'analyse de corrélation canonique régularisée59,60. Les valeurs de la matrice de similarité ont été calculées comme la corrélation entre les abondances relatives des familles bactériennes et les caractéristiques du milieu de culture projetées sur l'espace couvert par les premiers composants retenus dans l'analyse. Trois composantes pertinentes ont été obtenues en fixant un seuil de r ≥ 0,5 et des familles ont été disséminées dans la parcelle, en relation étroite avec les variables corrélées et avec le milieu de culture où elles étaient plus abondantes. Une procédure d'ordination supplémentaire, l'analyse des correspondances (CA), a été utilisée pour confirmer les relations entre les familles bactériennes spécifiques et les caractéristiques physiques et chimiques évaluées47.

Comment citer cet article : Grunert, O. et al. Les milieux de culture minéraux et organiques ont une structure communautaire, une stabilité et une fonctionnalité distinctes dans les systèmes de culture hors-sol. Sci. Rep. 6, 18837; doi : 10.1038/srep18837 (2016).

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Ce travail a été soutenu par la subvention de projet IWT Baekeland mandat 120200 et par la Fondation de recherche de Flandre (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen, FWO). Les auteurs remercient Guillaume Blanchet et Joris Meys pour leur soutien statistique. Nous remercions Iris Plumeier, Silke Kahl pour leur assistance technique, Tim Lacoere pour les illustrations de la Fig. 3 supplémentaire et Frederiek-Maarten Kerckhof, Nicole Hahn, Ruben Props, Amanda K. Luther et Stephen J. Andersen pour leurs conseils.

Grunert Oliver et Hernandez-Sanabria Emma ont également contribué à ce travail.

Laboratoire d'écologie et de technologie microbiennes (LabMET), Université de Gand, Coupure Links 653, Gand, B-9000, Belgique

Oliver Grunert, Emma Hernandez-Sanabria, Ramiro Vilchez-Vargas et Nico Boon

Département de production végétale, Université de Gand, Coupure Links 653, Gand, B-9000, Belgique

Marie-Christine Van Labeke & Dirk Reheul

Peltracom NV, Skaldenstraat 7a, Gand, B-9042, Desteldonk, Belgique

Oliver Grunert & Maaike Perneel

Département de biologie moléculaire des infections, Groupe de recherche sur les interactions et les processus microbiens, Centre Helmholtz pour la recherche sur les infections, Inhoffenstraße 7, Braunschweig, D-38124, Allemagne

Ruy Jauregui & Dietmar H. Pieper

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Concevoir et concevoir les expériences : OG, EH-S., MCVL, DR et NB Réaliser les expériences : OG, EH-S. Traitement des librairies Illumina : RJ et RV-V. Exploration de données, analyse statistique, interprétation des résultats, préparation de figures et de tableaux : EH-S. et OG Réactifs/matériels/outils d'analyse fournis : NB, MP et DHP Rédaction de l'article : OG et EH-S.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Grunert, O., Hernandez-Sanabria, E., Vilchez-Vargas, R. et al. Les milieux de culture minéraux et organiques ont une structure communautaire, une stabilité et une fonctionnalité distinctes dans les systèmes de culture hors-sol. Sci Rep 6, 18837 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18837

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Reçu : 19 juin 2015

Accepté : 25 novembre 2015

Publié: 05 janvier 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep18837

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Les milieux de culture minéraux et organiques ont une structure communautaire, une stabilité et une fonctionnalité distinctes dans les systèmes de culture hors-sol