Extrusion mécanosensible de l'entérovirus A71

Nature Microbiology volume 8, pages 629–639 (2023)Citer cet article

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L'entérovirus A71 provoque une maladie grave lors d'une infection systémique, entraînant parfois un dysfonctionnement neurologique potentiellement mortel. Cependant, dans la plupart des cas, l'infection est asymptomatique et limitée au tractus gastro-intestinal, où le virus est amplifié pour la transmission. Il a déjà été démontré que les picornavirus sortent des cellules infectées via la lyse cellulaire ou la sécrétion de vésicules. Nous rapportons ici que des cellules entières infectées par l'entérovirus A71 sont spécifiquement extrudées de la surface apicale d'organoïdes différenciés du côlon humain, comme observé par microscopie confocale. La sensibilité différentielle aux inhibiteurs chimiques et peptidiques a démontré que l'extrusion des cellules infectées par le virus dépend de la détection de force via les canaux ioniques mécanosensibles plutôt que de la mort cellulaire apoptotique. Lorsqu'elles sont isolées et utilisées comme inoculum, les cellules extrudées intactes contenant des virus peuvent initier de nouvelles infections. En revanche, lorsque la détection de force mécanique est inhibée, de grandes quantités de virus libres sont libérées. Ainsi, l'extrusion de cellules vivantes infectées par le virus à partir de tissu épithélial intact est susceptible de bénéficier à la fois à l'intégrité des tissus de l'hôte et à la propagation protégée de ce pathogène fécal-oral au sein et entre les hôtes.

La question de savoir comment les virus descendants quittent une cellule ou un tissu infecté est essentielle à notre compréhension de la propagation virale dans un hôte infecté et entre les hôtes. Pendant des décennies, on a pensé que les picornavirus, en tant que virus non enveloppés ou «nus», se transmettaient strictement par voie lytique, par rupture dramatique de la cellule infectée. La libération lytique de picornavirus à partir de lignées cellulaires de culture tissulaire standard entraîne une dispersion généralisée des virions pour initier des cycles d'infection ultérieurs. Cependant, une propagation non lytique a été démontrée pour plusieurs picornavirus, au cours de laquelle les virus s'approprient des membranes intracellulaires pour faciliter leur libération à partir de cellules intactes, masquées dans des vésicules extracellulaires1,2,3,4. Une conséquence de cette stratégie de transmission est qu'au lieu de la propagation dispersive de particules virales uniques, les virus sont transmis en bloc dans des paquets membranaires5.

Les modèles organoïdes épithéliaux sont des outils passionnants pour examiner les réponses spécifiques aux tissus aux insultes pathogènes6,7. Les organoïdes sphériques 3D dérivés de cellules souches adultes peuvent être différenciés pour récapituler la diversité des types de cellules présentes dans les tissus natifs8. Les organoïdes se développent généralement avec leurs surfaces apicales faisant face aux compartiments luminaux intérieurs. Des monocouches polarisées 2D ou des organoïdes qui ont été cisaillés mécaniquement pour permettre l'accès apical de l'entérovirus A71 (EV-A71) ont été utilisés pour modéliser l'infection par EV-A71 de l'épithélium gastro-intestinal9,10,11. Récemment, des méthodes pour inverser la topologie organoïde ont été développées pour présenter directement la surface apicale des épithéliums gastro-intestinaux aux pathogènes entériques tout en préservant l'intégrité épithéliale12,13. Dans cet article, ces organoïdes apicaux sont utilisés pour surveiller l'infection des cellules épithéliales par EV-A71 et les mécanismes ultérieurs de propagation virale dans ce tissu.

Nous étions intéressés à utiliser des organoïdes épithéliaux gastro-intestinaux apicaux comme modèle d'infection par EV-A71 dans lequel l'intégrité de la barrière épithéliale est maintenue. Nous avons choisi d'utiliser des organoïdes dérivés du tissu colique (colonoïdes), en raison de la proximité du côlon avec la sortie virale d'un hôte infecté, pour mieux comprendre la transmission de l'EV-A71. Des colonoïdes dérivés de tissus de cryptes humaines adultes ont été cultivés sur des échafaudages de membrane basale en présence de facteurs souches, notamment le WNT et la R-spondine, générant des sphéroïdes de cellules souches avec leur surface basolatérale tournée vers l'extérieur et leurs surfaces luminales et apicales tournées vers l'intérieur. Cinq jours avant l'infection, les colonoïdes ont été retirés de l'échafaudage de la membrane basale et maintenus en culture en suspension en l'absence de matrice pour induire l'inversion de la topologie organoïde afin que les surfaces apicales soient à l'extérieur de l'organoïde (apical-out)12. En même temps, un milieu pour induire la différenciation cellulaire a été appliqué. Dans ces colonoïdes humains apicaux, nous avons surveillé l'organisation du cytosquelette d'actine et du récepteur EV-A71 SCARB2 (Fig. 1a). La surface apicale des colonoïdes bien différenciés et polarisés contient des microvillosités en bordure de brosse, qui sont facilement identifiables avec la coloration à l'actine F sous la forme d'une couche épaisse riche en actine. SCARB2 est une protéine membranaire lysosomale intégrale qui se déplace vers la surface apicale des monocouches polarisées14,15 et a été abondamment exprimée dans ces colonoïdes apicaux (Fig. 1a).

a, Apical-out, les organoïdes épithéliaux différenciés du côlon expriment le récepteur EV-A71 SCARB2 (rouge), se localisant sur les membranes intracellulaires. L'intégrité de la bordure en brosse des microvillosités d'actine apicale (blanche) est visible. b, les organoïdes du côlon ont été infectés par EV-A71. Les titres viraux ont été suivis au fil du temps par dosage sur plaque. Les données de quatre expériences indépendantes utilisant deux donneurs de colonoïdes différents sont présentées. c, les cellules infectées par EV-A71 ont été observées par dosage d'immunofluorescence après coloration de l'ARNv double brin après 48 h d'infection. Droite : grossissement accru de la cellule infectée indiquée par une pointe de flèche jaune dans le panneau de gauche. Barres d'échelle, 10 μm.

Données source

Les courbes de croissance virale commençant immédiatement après l'infection ont montré qu'EV-A71 pouvait infecter de manière productive des colonoïdes apicaux différenciés de deux donneurs humains différents, l'accumulation de virus dans la culture se poursuivant jusqu'à 48 h après l'infection (Fig. 1b). À ce moment-là, les colonoïdes infectés ont été fixés, colorés et examinés par microscopie confocale pour la présence d'ARN viral double brin (ARNv), qui est apparent dans les cellules infectées après fixation, pour identifier les complexes de réplication d'ARNv. Des motifs de coloration juxtanucléaires et cytoplasmiques ponctués indiquant des complexes de réplication d'ARNv ont été facilement observés (Fig. 1c). Curieusement, la majorité des cellules infectées étaient solitaires parmi leurs voisines non infectées.

L'absence de propagation virale observable, alors même que le rendement viral augmentait, pourrait être rationalisée après une inspection minutieuse des surfaces apicales des colonoïdes infectés. Nous avons été surpris par l'observation fréquente de cellules infectées par le virus qui semblaient sortir de colonoïdes intacts (Fig. 2a – c). Dans les épithéliums gastro-intestinaux sains, l'extrusion de cellules entières maintient le nombre de cellules homéostatiques en facilitant l'élimination des cellules existantes pour correspondre au taux d'expansion des cellules souches dans les cryptes. En fait, tant de cellules sont extrudées que la durée de vie moyenne d'une cellule épithéliale gastro-intestinale n'est que de 2 à 5 jours16,17. Pour déterminer si les fréquences auxquelles l'extrusion de cellules infectées par EV-A71 dépassaient celles des cellules non infectées, nous avons quantifié la fréquence à laquelle les cellules infectées et non infectées ont subi une extrusion à partir des mêmes colonoïdes infectés par EV-A71 (Fig. 2d, e et Tableau supplémentaire 1). Les colonoïdes infectés ont été fixés, colorés et examinés par microscopie confocale. Les cellules individuelles ont été classées comme (1) infectées ou non infectées et (2) extrudées ou non extrudées. Une cellule a été définie comme s'extrudant d'un organoïde si son noyau avait traversé la frontière apicale de l'organoïde, visualisée en colorant l'actine corticale avec de la phalloïdine. Au bout de 48 h examiné, 40 % des cellules infectées s'extrudaient, contre seulement 1 % des cellules non infectées (Fig. 2d et Tableau supplémentaire 1). De même, bien que les cellules infectées ne constituaient que 0, 4% des cellules des organoïdes, elles constituaient 25% des cellules en extrusion (Fig. 2e et tableau supplémentaire 1). Ces données démontrent que les cellules infectées sont extrudées des colonoïdes à des fréquences significativement plus élevées que prévu par hasard.

a–c, les colonoïdes infectés ont été fixés 48 h après l'infection et colorés pour l'ARNv double brin. d, les cellules infectées ont été extrudées des colonoïdes avec une fréquence plus élevée que les cellules non infectées. Les pourcentages de cellules infectées ou non infectées sortant d'un organoïde individuel sont représentés par de petits cercles. La proportion de cellules extrudées dans tous les organoïdes de chaque expérience est représentée par des triangles de la même couleur que les colonoïdes individuels. Au moins dix organoïdes ont été quantifiés par expérience : ** P < 0,01 ; test t bilatéral apparié, N = 3 expériences. e, les pourcentages de cellules extrudées et non extrudées infectées ont été mesurés de manière similaire. Parmi les cellules qui s'extrudaient, un pourcentage plus élevé était infecté. **P < 0,01 ; ANOVA unidirectionnelle à mesures répétées avec le test de comparaisons multiples de Tukey, N = 3 expériences. En d et e, les nombres de cellules brutes représentées dans les graphiques sont affichés dans le tableau supplémentaire 1. f, les colonoïdes infectés par EV-A71 ont été colorés pour l'expression de Muc2, un marqueur des cellules caliciformes. La pointe de flèche indique une cellule infectée. La flèche indique la cellule caliciforme illustrée en g. g, cellule caliciforme exprimant Muc2. h,i, l'expression de Villin identifie les colonocytes. Villin se localise apicalement, chevauchant la bordure en brosse de microvillosités riche en actine. Des cellules individuelles distinctes sont affichées. j, k, les colonoïdes infectés par EV-A71 ont été colorés pour l'expression de Villin. 1, des cellules infectées représentatives de l'extrusion sont montrées. m, les étapes de l'extrusion canonique des cellules dans les épithéliums non infectés sont représentées. n, o, Des cellules infectées par le poliovirus de type 1 (Mahoney) ont été observées expulsant des organoïdes de l'iléon par immunofluorescence. o montre une cellule individuelle mise en évidence dans n. Barres d'échelle, 10 μm. En d et e, les barres horizontales et d'erreur représentent la moyenne ± sd

Données source

Pour identifier le type de cellule permissif chez les colonoïdes, nous avons effectué une immunocoloration avec des anticorps ciblant Villin1 et Muc2, exprimés respectivement par les colonocytes absorbants et les cellules caliciformes (Fig. 2f – k). Les deux types de cellules ont déjà été impliqués dans l'infection par EV-A71 dans l'épithélium gastro-intestinal10,11. Nos observations suggèrent que les colonocytes absorbants, plutôt que les cellules caliciformes, étaient le type de cellule principalement infecté dans ce modèle. Cette découverte n'exclut pas l'infection des cellules caliciformes dans les épithéliums dans lesquels les cellules caliciformes sont plus abondantes.

Nous avons observé des cellules infectées dans plusieurs états distincts rappelant les étapes de l'extrusion canonique de cellules entières (Fig. 2l, m). L'extrusion cellulaire est un processus hautement coordonné qui permet l'élimination des cellules indésirables tout en maintenant l'intégrité de la barrière épithéliale18,19. Au cours de l'extrusion canonique, les cellules destinées à l'extrusion et leurs cellules voisines réarrangent leurs cytosquelettes pour entourer la base des cellules en extrusion; ces anneaux actine-myosine se contractent apicalement pour faire sortir les cellules extrudées par ce que l'on a appelé un mécanisme de «cordon de bourse» (Fig. 2n)20. Dans le même temps, des jonctions serrées se reforment entre les nouvelles cellules voisines sous les cellules en extrusion pour maintenir l'intégrité épithéliale21,22. Le déplacement des cellules et la formation de nouveaux voisins se produisent sur une période d'environ 40 min. Les cellules extrudées s'accrochent à l'épithélium pendant 40 minutes supplémentaires avant de se détacher de leurs voisines et de flotter20,23. Nous avons observé des cellules infectées dans des états compatibles avec les stades précoce et tardif de l'extrusion, comme le montre la figure 2l. Sur la gauche, une cellule infectée peut être vue intégrée dans un organoïde, entourée d'une couche d'actine se condensant sous la cellule infectée. L'image du milieu montre une cellule extrudée toujours en contact avec une surface apicale reformée et intacte. La cellule infectée entièrement détachée sur la droite a été observée flottant en suspension aux côtés d'organoïdes infectés.

Pour déterminer si le phénomène d'extrusion de cellules infectées était spécifique à EV-A71, nous avons examiné des cellules infectées par le poliovirus, un membre de l'espèce apparentée d'entérovirus C. Dans les organoïdes dérivés du tissu iléal de l'intestin grêle ainsi que du tissu colique, l'extrusion de cellules infectées par le poliovirus a été facilement observée (Fig. 2n, o et Extended Data Fig. 1). Nous suggérons que plusieurs entérovirus provoquent l'éjection des cellules infectées des organoïdes gastro-intestinaux par extrusion de cellules entières. Nous nous sommes également demandé si l'extrusion de cellules infectées par EV-A71 était spécifique à l'architecture épithéliale des organoïdes apicaux. Cependant, l'extrusion de cellules infectées a été facilement observée dans les colonoïdes contrastés basolatéralement (Extended Data Fig. 2).

Pour caractériser le moment de l'extrusion des cellules infectées, nous avons visualisé les cellules infectées dans les colonoïdes au cours du premier cycle d'infection (données étendues Fig. 3 et tableau supplémentaire 2). Nous avons observé que les cellules infectées peuvent être extrudées dès 5 h et aussi tard que 9 h après l'infection, et que l'extrusion des cellules infectées à tous les moments contenait de l'ARNv abondant. Par conséquent, les différences de cellule à cellule dans la cinétique d'infection24 contribuent probablement au moment de l'extrusion. Le nombre de cellules infectées dans les colonoïdes a augmenté de manière significative de 5 h à 7 h après l'infection, mais a considérablement diminué par la suite, même si la quantité de virus infectieux dans l'ensemble de la culture a continué d'augmenter (Fig. 1b). Le fait que les cellules infectées soient principalement éliminées entre 7 h et 9 h après l'infection est cohérent avec l'absence de transmission de cellule à cellule observée au sein des colonoïdes.

L'extrusion de cellules apoptotiques à partir d'épithéliums intacts a été décrite à l'origine comme un moyen d'éliminer les cellules mourantes sans compromettre la barrière épithéliale20. Étant donné que l'infection par EV-A71 peut déclencher l'apoptose dans plusieurs types de cellules25,26,27,28, nous avons testé si la signalisation apoptotique déclenche l'extrusion des cellules infectées dans les colonoïdes. Nous avons utilisé un substrat fluorogène (CellEvent, ThermoFisher) pour visualiser les cellules qui exprimaient les caspases actives 3 et 7. Les organoïdes infectés ont été incubés avec le substrat, fixés, colorés pour l'ARN double brin et examinés par microscopie confocale (Fig. 3a – e). Environ la moitié des cellules extrudées non infectées étaient positives pour la caspase 3/7, ce qui correspond au fonctionnement normal de l'extrusion cellulaire dans l'épithélium intestinal29. Cependant, une fraction significativement plus faible de cellules infectées en extrusion était positive à la caspase 3/7 (Fig. 3f et tableau supplémentaire 3). De plus, les noyaux des cellules infectées en extrusion étaient généralement intacts et ne présentaient pas les noyaux condensés et fragmentés caractéristiques des cellules apoptotiques. Ces données soutiennent que le stress apoptotique ne provoque pas d'extrusion de cellules infectées.

Les colonoïdes infectés ont été visualisés par microscopie confocale à immunofluorescence après 48 h d'infection. L'activité des caspases 3 et 7 a été visualisée à l'aide d'un substrat fluorogène. a, Organoïdes infectés individuels avec des cellules en extrusion. b, Grossissement accru d'une seule cellule d'extrusion apoptotique non infectée dans a. c, Grossissement accru de deux cellules infectées non apoptotiques en extrusion dans a. d, Organoïdes infectés individuels avec des cellules en extrusion. e, grossissement de deux cellules d'extrusion en d. f, les proportions de cellules extrudées infectées et non infectées qui étaient apoptotiques ont été quantifiées, les valeurs globales pour chaque expérience étant représentées par des triangles. Chaque couleur représente une expérience indépendante, avec des mesures pour chaque organoïde individuel représenté par de petits cercles. *P < 0,05 ; test t bilatéral apparié, N = 3 ; les barres horizontales et d'erreur représentent la moyenne ± sd Les nombres de cellules brutes représentés dans ce graphique sont affichés dans le tableau supplémentaire 3. Barres d'échelle, 10 µm.

Données source

En plus de la mort cellulaire apoptotique ou pyroptotique, l'extrusion cellulaire de l'épithélium gastro-intestinal peut être déclenchée par des forces mécaniques sur les cellules dues au surpeuplement30,31. Bien qu'il ne joue aucun rôle dans l'extrusion des cellules apoptotiques, le canal ionique mécanosensible Piezo1 détecte et répond au stress d'encombrement cellulaire, déclenchant l'extrusion cellulaire29. Nous avons émis l'hypothèse que l'altération des propriétés biomécaniques des cellules infectées peut être détectée par Piezo1, conduisant à une extrusion dépendante de la force des cellules infectées. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité des colonoïdes infectés avec GsMTx4, un peptide de venin d'araignée qui inhibe l'activité des canaux ioniques mécanosensibles, y compris Piezo1 (réfs. 32,33). Nous avons également évalué l'effet de Z-VAD-FMK, un inhibiteur de pan-caspase connu pour réduire l'extrusion cellulaire apoptotique23. Enfin, étant donné que le réarrangement actine-myosine est essentiel pour l'extrusion cellulaire quel que soit le déclencheur initial, nous avons testé l'effet de l'inhibiteur de myosine II para-nitro-blebbistatin34 en tant que contrôle positif pour l'inhibition de tous les mécanismes d'extrusion cellulaire35,36 (Fig. 4e).

Des organoïdes infectés par EV-A71 ont été exposés à des composés capables d'inhiber des facteurs cellulaires impliqués dans différents mécanismes d'extrusion. a – d, les organoïdes infectés ont été exposés à 0, 5% de contrôle de véhicule DMSO ( a ), 50 μM de para-nitro-blebbistatin ( b ), 100 μ M de Z-VAD-FMK ( c ) ou 20 μ M de GsMTx4 ( d ). Les cellules infectées dans les organoïdes ont été inspectées visuellement par microscopie confocale. Les pointes de flèches jaunes indiquent les cellules infectées dans les organoïdes représentatifs. Barres d'échelle, 10 μm. e, Blebbistatin inhibe à la fois les extrusions apoptotiques et mécanosensibles, Z-VAD-FMK inhibe uniquement l'extrusion apoptotique et GsMTx4 inhibe uniquement l'extrusion mécanosensible. f, Le pourcentage de cellules infectées subissant une extrusion après 7 h d'infection a été dénombré. Chaque couleur montre une expérience indépendante. Proportion globale de cellules infectées extrudées par expérience représentées par des triangles, avec des mesures pour chaque organoïde représentées par de petits cercles. **P < 0,01 ; NS, non significatif ; Mesures répétées ANOVA unidirectionnelle avec test de comparaisons multiples de Dunnett, N = 3. g, Les titres viraux quantifiés à 7 h après l'infection à partir de cultures organoïdes en suspension infectées ne montrent aucun effet significatif des traitements médicamenteux sur le rendement en virus. ANOVA unidirectionnelle à mesures répétées avec le test de comparaisons multiples de Dunnett, N = 3 infections indépendantes. En f et g, les barres horizontales et d'erreur représentent la moyenne ± sd

Données source

Après 2 h d'infection par EV-A71, les colonoïdes ont été traités avec les composés ci-dessus pendant le reste d'un seul cycle d'infection (Fig. 4a – d). La proportion de cellules infectées sortant des colonoïdes a été quantifiée dans chaque condition (Fig. 4f). Comme prévu, le pourcentage de cellules infectées extrudées à partir d'organoïdes a été réduit en présence de blebbistatin et non affecté par Z-VAD-FMK, qui inhibe uniquement l'extrusion apoptotique. Cependant, nous avons observé une réduction frappante du pourcentage de cellules infectées subissant une extrusion en présence de l'inhibiteur de canal ionique mécanosensible GsMTx4 (Fig. 4f). Pour exclure la possibilité que cela soit dû à l'inhibition de la croissance virale, nous avons évalué l'effet de tous les composés sur le rendement viral, dont aucun n'a été modifié (Fig. 4g). Ces résultats soutiennent que c'est l'activité de détection de force des canaux ioniques mécanosensibles ciblés par GsMTx4 qui est cruciale pour l'élimination des cellules vivantes infectées par EV-A71.

Pour déterminer si les cellules infectées extrudées pouvaient fournir une source de propagation virale dans le tractus gastro-intestinal, les cellules extrudées (cellules) ont été collectées par sédimentation différentielle (méthodes) et la quantité de virus qu'elles contenaient a été déterminée. Pour confirmer que les étapes de lavage éliminent efficacement le virus acellulaire de la fraction Cellules, 106 unités formant plaque de virus exogène ont été introduites dans un ensemble d'échantillons (Cellules + Milieu). Le virus enrichi a considérablement augmenté le titre viral dans les échantillons Cells + Media (Fig. 5b). Cependant, le titre viral dans les cellules était inchangé par le pic de virus exogène, démontrant que les lavages ont réussi à éliminer le virus libre potentiellement contaminant. De plus, comme le montre la figure 5c, il y avait significativement plus de virus infectieux dans les fractions de cellules extrudées que dans les milieux sans cellules.

a, des cultures de colonoïdes infectées par EV-A71 ont été collectées 8 h après l'infection et les composants ont été collectés par sédimentation différentielle. b, Pour évaluer l'efficacité du lavage des cellules extrudées, 106 PFU de virus libre exogène ont été injectés dans des échantillons Cells + Media. Les fractions comprenant Whole Well (barres vides), Cells + Media (petites barres en pointillés) et Cellules (grandes barres en pointillés) ont été soumises à un test de congélation-décongélation et de plaque. ANOVA unidirectionnelle à mesures répétées avec le test de comparaisons multiples de Holm – Šídák. NS, non significatif. c, distribution du virus dans les cellules et dans les médias. Rapport t-test bilatéral apparié. d, Stabilité du virus à partir des fractions Cellules et Médias. Les fractions collectées ont été incubées à 37 ° C pendant les durées indiquées, soumises à des cycles de congélation-décongélation répétitifs et à un test de plaque ultérieur. Les quantités de virus sont normalisées aux valeurs de c avant l'incubation. ANOVA à deux facteurs avec correction de Geisser-Greenhouse. e, les fractions de cellules extrudées intactes et le virus libre du lavage final des cellules ont été utilisés pour infecter les monocouches de cellules RD. Les titres viraux dans les cellules RD infectées ont été mesurés 1 h et 16 h après le début de l'infection secondaire. Rapport apparié (cellules-cellules; lavage-lavage) et non apparié (lavage-cellules), tests t bilatéraux. La ligne pointillée indique la limite de détection. f, les fractions cellulaires et le virus libre du lavage final des cellules ont été utilisés pour infecter de nouveaux colonoïdes. Après 2 h et 16 h, la quantité de virus dans les fractions Whole Well a été déterminée par dosage sur plaque. Les tests statistiques tels que décrits dans e. g, h, microscopie confocale de cellules RD secondairement infectées (g) et d'organoïdes inoculés avec des cellules après 16 h (h). Barres d'échelle, 10 μm. h, Organoïde secondairement infecté avec plusieurs cellules infectées. En bas : coupe transversale orthogonale à travers la cellule secondairement infectée, extrudée indiquée par une pointe de flèche jaune. i, les cultures de colonoïdes infectées par EV-A71 ont été traitées avec du GsMTx4 ou un véhicule, et des fractions ont été collectées après 8 h. Alors que le traitement par GsMTx4 réduisait la quantité de virus infectieux dans les cellules extrudées, la quantité de virus infectieux libres dans le milieu augmentait. Plusieurs tests t appariés et bilatéraux avec la correction Holm – Šídák pour des comparaisons multiples. En b–f et i, une expérience représentative est montrée avec des infections indépendantes réalisées en triple ; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 ; les données représentées sont la moyenne ± sd

Données source

Pour déterminer combien de temps les cellules extrudées sont restées vivantes après l'extrusion, nous avons surveillé l'état apoptotique des cellules après 48 h. À ce moment-là, la majorité des cellules extrudées infectées et non infectées étaient positives pour la caspase 3/7 (Extended Data Fig. 4), ce qui suggère que les cellules extrudées à la suite d'une infection virale subissent éventuellement une mort cellulaire apoptotique induite par le détachement. Pour tester si la résidence dans ces cellules mourantes et extrudées a endommagé les virions résidents, les préparations de cellules et de milieux illustrées à la figure 5c ont été incubées à 37 ° C. Tous les échantillons ont été soumis à une congélation-décongélation répétitive pour lyser les cellules avant le test sur plaque. Sur une période de 48 h, le virus résidant dans les cellules a conservé sa stabilité de la même manière que le virus libre dans le milieu (Fig. 5d). Par conséquent, les cellules infectées expulsées des épithéliums coliques contiennent un virus infectieux stable.

Pour déterminer si les cellules extrudées sont elles-mêmes infectieuses, des fractions cellulaires ont été préparées à partir de colonoïdes infectés et utilisées comme inocula pour les infections secondaires (Fig. 5e, f). La croissance virale à la fois dans les monocouches de cellules de rhabdomyosarcome (RD) infectées secondairement et dans les colonoïdes précédemment non infectés a été examinée en comparant les titres immédiatement après l'infection et après 16 h d'infection. Comme témoin pour un isolement efficace des cellules de tout virus libre restant, les surnageants du dernier des trois lavages ont également été utilisés comme inoculum. Dans les cultures infectées par des cellules extrudées à partir d'organoïdes précédemment infectés, un virus abondant était présent immédiatement après l'infection (Fig. 5e, f) et des augmentations significatives ont été observées lors de l'incubation. Fait important, après 16 h, la quantité de virus dans les cultures infectées par des cellules extrudées était significativement plus élevée que celle des cultures infectées par le surnageant de lavage, indiquant que la présence de cellules extrudées, plutôt que de virus acellulaire résiduel, était responsable des charges virales élevées. La microscopie confocale a confirmé la présence de cellules infectées dans les monocouches et les colonoïdes RD secondairement infectés (Fig. 5g, h). Par conséquent, les cellules extrudées contenant des virus sont infectieuses à la fois pour les monocouches RD et pour les colonoïdes différenciés apicaux.

Pour déterminer le sort des virus et des cellules retenus dans la couche épithéliale des colonoïdes lorsque l'extrusion a été inhibée, les colonoïdes ont été infectés par EV-A71 et des fractions Whole Well, Organoid, Cells et Media (Fig. 5a) ont été collectées par sédimentation différentielle (Méthodes, données étendues Fig. 5 et tableau supplémentaire 4). Les échantillons ont été soumis à une congélation-décongélation répétitive pour libérer le virus intracellulaire avant le test sur plaque. Comme prévu, l'inhibition de la détection de force par un traitement avec GsMTx4 n'a pas affecté la croissance virale globale, comme en témoigne la fraction Whole Well, bien que beaucoup moins de virus aient été trouvés dans la fraction de cellules extrudées. La quantité de virus infectieux dans les organoïdes intacts n'a pas été augmentée par le traitement GsMTx4, même si la libération des cellules infectées a été bloquée. Au lieu de cela, beaucoup plus de virus ont été observés dans la fraction Media lorsque l'extrusion a été bloquée (Fig. 5i). Nous supposons que l'extrusion de cellules de la couche épithéliale empêche le résultat qui se produirait autrement : la libération de virus acellulaires.

Les cellules infectées subissent une variété de stress métaboliques, oxydatifs et de mauvais repliement qui déclenchent des réponses cellulaires innées telles que l'apoptose, l'autophagie et la synthèse de médiateurs inflammatoires. Les virus efficaces inhibent ou subvertissent bon nombre de ces réponses pour améliorer la réplication virale. Nous rapportons ici que EV-A71 affecte également les voies de signalisation mécanosensorielles. Dans les cellules polarisées des organoïdes du côlon, les cellules infectées par EV-A71 sont préférentiellement extrudées dans le milieu extracellulaire apical qui correspond à la lumière colique. Ce procédé pourrait être avantageux à la fois pour l'hôte, en éliminant les cellules infectées de l'épithélium intestinal, et pour la population virale, dont l'extrusion collective facilite probablement la transmission inter-hôte. Chez les souris infectées par EV-A71, un raccourcissement des villosités intestinales a déjà été observé37,38. Le raccourcissement villeux dans d'autres contextes pathologiques résulte de taux accrus de perte de cellules par extrusion39. Par conséquent, l'expulsion mécanosensible des cellules infectées des organoïdes est cohérente avec, et peut expliquer, ces observations in vivo.

Dans ce travail, nous avons montré que l'extrusion d'entérocytes infectés par EV-A71 à partir de colonoïdes humains polarisés est entravée par le petit peptide GsMTx4, un inhibiteur des canaux ioniques mécanosensibles33. Ces données impliquent la détection de force comme déclencheur de l'extrusion des cellules infectées. Dans les monocouches polarisées cultivées et les épithéliums intestinaux, le canal ionique sensible à la force Piezo1 est connu pour agir comme un capteur pour l'homéostasie de la densité cellulaire29,40. Lorsque les épithéliums sont surpeuplés, Piezo1 induit l'extrusion de cellules vivantes non apoptotiques jusqu'à ce que le nombre de cellules homéostatiques soit rétabli29. Les protéines piézo sont des homotrimères incorporés dans la membrane plasmique, avec des bras en forme d'hélice et un pore central perméable au Ca+241. Lors de la déformation de la membrane plasmique par une force mécanique, les bras sont censés se repositionner, induisant un changement de conformation dans lequel le pore s'ouvre41. Nous postulons que Piezo1 est un candidat probable pour l'extrusion forcée de cellules infectées rapportée ici.

Dans cette étude, nous avons observé que les cellules infectées sortant des colonoïdes humains étaient arrondies et avaient perdu les microvillosités d'actine sur leurs surfaces apicales. En revanche, les cellules infectées au sein des colonoïdes semblaient similaires en taille et en forme aux voisins non infectés. Les entérovirus sont connus pour provoquer une réorganisation globale des composants de la cellule hôte, y compris tous les éléments du cytosquelette42,43,44. En effet, les réarrangements drastiques du cytosquelette sont des contributeurs majeurs à la description souvent utilisée de «l'effet cytopathique» causé par de nombreux virus45. La réduction de la tension membranaire et de l'attache du cytosquelette a été impliquée dans l'activation de Piezo141,46,47. Il est probable que les perturbations du cytosquelette induites par une infection virale modifient les propriétés biomécaniques des cellules infectées par EV-A71, conduisant à l'activation de Piezo1 et à l'extrusion ultérieure (Extended Data Fig. 6).

L'élimination des cellules infectées par la compétition cellulaire mécanique pourrait bénéficier à l'hôte en limitant la propagation virale locale dans les tissus infectés. De plus, lorsque l'extrusion était bloquée, une augmentation du virus extracellulaire a été observée, suggérant que les cellules infectées contraintes de rester dans les organoïdes libèrent le virus dans le milieu par lyse ou sécrétion non conventionnelle. Si les cellules infectées sont au bord de la lyse, leur extrusion pourrait bénéficier à l'hôte en maintenant la barrière épithéliale, en réduisant l'inflammation, ou les deux (Fig. 6).

Les cellules infectées par EV-A71 extrudées du côlon dans la lumière gastro-intestinale peuvent jouer un rôle essentiel dans la transmission fécale-orale. Lorsque des cellules porteuses de virus infectieux sont extrudées, on s'attend à ce que les virions descendants transitent par l'intestin et soient excrétés dans les selles à l'intérieur des cellules extrudées vivantes. Dans les cellules, les virions peuvent être protégés du contenu intestinal tel que les anticorps muqueux. Le regroupement intracellulaire des virions pourrait en outre faciliter la transmission en bloc, permettant de maintenir la diversité génomique virale. Le potentiel d'avantages pour l'hôte de l'extrusion de cellules infectées in vivo, comme une clairance virale plus rapide ou une tolérance améliorée à l'infection, reste des questions ouvertes intrigantes pour une étude plus approfondie.

Les cellules extrudées pourraient également servir de moyen de propagation virale d'une région du tissu gastro-intestinal à une région plus distale du même hôte ou à un autre hôte (Fig. 6). Nous avons constaté que les cellules infectées par EV-A71 elles-mêmes sont infectieuses à la fois pour les monocouches cellulaires et pour les organoïdes précédemment non infectés. Le transit à travers le côlon dans une cellule extrudée pourrait protéger les virions du contenu luminal tel que les anticorps muqueux (Fig. 6). Une telle délivrance virale en bloc peut avoir plusieurs conséquences, en raison de la transmission de virus concentrés et du maintien de la complexité de la population de quasi-espèces virales intracellulaires5,48,49,50.

Nos découvertes s'ajoutent à un nombre croissant de preuves que les agents pathogènes intracellulaires peuvent être éliminés des couches épithéliales par l'éjection contrôlée des cellules infectées via une variété de mécanismes. Le rotavirus, le réovirus, le virus respiratoire syncytial et Salmonella déclenchent tous la mort cellulaire pyroptotique ou apoptotique dans des cellules infectées uniques qui sont ensuite extrudées31,51,52,53,54. En revanche, Listeria et le virus de la rougeole induisent tous deux une excrétion massive, avec des dizaines de cellules infectées vivantes formant de grands monticules qui s'agrègent au sommet d'épithéliums polarisés36,55,56. Le phénomène unique d'extrusion unicellulaire dépendante de la force des cellules infectées décrit ici peut accompagner l'infection par des agents pathogènes intracellulaires supplémentaires qui restent à identifier.

En résumé, ces découvertes identifient le phénomène d'extrusion vivante de cellules infectées par le virus initiée par l'activité mécanosensible des canaux ioniques. L'extrusion mécanosensible peut servir une fonction immunitaire innée cruciale en initiant l'expulsion des cellules infectées du tissu épithélial. De plus, étant donné que les cellules extrudées peuvent initier une nouvelle infection virale, l'excrétion de cellules infectées par le virus peut servir de moyen de transmission féco-orale jusque-là méconnu.

Les organoïdes ont été générés selon les principes décrits dans la réf. 8. Les organoïdes épithéliaux gastro-intestinaux ont été générés précédemment par le laboratoire de Calvin Kuo à l'Université de Stanford13, par dissection de biopsies de tissus gastro-intestinaux humains adultes sains. Ceux-ci ont été anonymisés et obtenus par la Stanford Tissue Bank avec le consentement du patient et l'approbation du comité d'examen institutionnel de l'Université de Stanford. Des biopsies tissulaires ont été acquises sans recueillir spécifiquement d'informations sur l'âge et le sexe des patients, et aucun recrutement ciblé ou planifié particulier n'a été effectué (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124719301457?via%3Dihub).

Pour l'entretien, les organoïdes ont été ensemencés dans la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduite Cultrex, type II (BME, équivalent à Matrigel) en gouttelettes dans une plaque traitée pour culture tissulaire à 24 puits (40 µl par puits). Le BME a été polymérisé par incubation pendant 10 min à 37 ° C, puis le milieu de croissance a été superposé au BME. Le milieu de croissance consiste en un milieu Eagle modifié de Advanced Dulbecco (DMEM)/F12, 1 mM HEPES, 1 × Glutamax, 1 × B27 (sans vitamine A), 1 mM N-acétyl-cystéine (pour les échantillons intestinaux et coliques uniquement), 10 nM gastrine, 50 ng ml−1 facteur de croissance épidermique, 10 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 10 µM SB202190, 100 ng ml-1 FGF10 (pour les échantillons gastriques uniquement) et 50 % de milieu conditionné L-WRN (contient Wnt3a, R-spondine 3 et Noggin). Le milieu conditionné L-WRN a été préparé à partir de cellules L-WRN57. Le milieu conditionné L-WRN a été aliquoté et congelé à -80 ° C pour un stockage à long terme sans aucun effet négatif sur la croissance des organoïdes observé. Le milieu de croissance a été remplacé tous les 1 à 4 jours selon les besoins.

Au passage, les organoïdes ont été dissociés en cellules individuelles dans TrypLE Express pendant 10 à 15 min à 37 ° C, interrompus manuellement par pipetage, puis la trypsine a été inactivée avec du FBS. Sur de la glace, les cellules ont été filtrées à travers une passoire à mailles en nylon à pores de 70 µm pour éliminer les gros amas de cellules ou les organoïdes non dissociés. Les cellules ont été comptées sur un compteur de cellules Countess II (ThermoFisher) et réensemencées dans du BME à une concentration de 5 × 103 à 1,5 × 104 cellules par puits. Pendant 2 à 3 jours après le passage initial, 10 µM de Y27623 et 250 nM de CHIR99021 ont été inclus dans le milieu de croissance pour empêcher la mort cellulaire induite par le détachement. Les organoïdes ont été passés tous les 4 à 10 jours selon les besoins. Tous les organoïdes utilisés ont été testés avec Myco-Sniff (MP Biomedicals) pour s'assurer qu'aucune contamination par les mycoplasmes n'était présente.

Après 4 à 7 jours de croissance, les organoïdes ont été retirés du Matrigel et amenés à inverser leur polarité afin d'exposer la surface apicale12. Les organoïdes ont été incubés dans 5 mM d'EDTA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C pendant 40 min, lavés avec du DMEM et remis en suspension dans un milieu de différenciation: Advanced DMEM / F12, 1 mM HEPES, 1 × Glutamax, 1 × B27, 1 mM N-acétyl-cystéine (pour les échantillons intestinaux et coliques uniquement), 10 nM gastrine, 50 ng ml -1 facteur de croissance épidermique, 10 ng ml-1 Noggin, 500 nM A83-01, 5 µM γ-Secretase Inhibitor IX (également connu sous le nom de DAPT, échantillons coliques uniquement), 100 ng ml-1 FGF10 (pour les échantillons gastriques uniquement) et 10 µM Y27623. Les organoïdes en culture en suspension ont été étalés dans des plaques ou des flacons à très faible attachement (Corning Costar) et incubés à 37 ° C pendant 5 jours pour achever la différenciation et l'inversion de polarité avant utilisation expérimentale.

Les cellules RD, un cadeau du laboratoire de Peter Sarnow, ont été cultivées dans du DMEM (Hyclone ; 4 500 mg l-1 de glucose, 4 mM de l-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (Omega Life Sciences), 1 × acides aminés non essentiels (MEM NEAA, Gibco) et 1 × pénicilline-streptomycine (Gibco). Les cellules RD ont été cultivées à 37°C avec 5% de CO2. Les cellules HeLa ont été cultivées dans du DMEM (Hyclone; 4 500 mg l-1 de glucose, 4 mM de l-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Omega Life Sciences) et de 1 × pénicilline-streptomycine (Gibco). Ni les cellules RD ni les cellules HeLa ne figurent sur la liste des lignées cellulaires mal identifiées connues maintenue par l'International Cell Line Authentication Committee (https://iclac.org/databases/cross-contaminations/). Des informations sur l'authentification des lignées cellulaires peuvent être trouvées dans les informations supplémentaires.

La souche EV-A71 Taiwan/4643/98 a été amplifiée à partir d'un clone infectieux produit par le laboratoire de Jen-Ren Wang à l'aide de cellules RD58. La séquence d'ADN complémentaire complète de la souche virale utilisée peut être trouvée sous le numéro d'accès GenBank JN544418. Des stocks de virus provenant du deuxième passage viral dans des cellules RD ont été générés et utilisés pour les infections. Le titre viral a été déterminé par dosage sur plaque sur des cellules RD, en utilisant une couche d'agarose à 0,3 % (p/v) ; les plaques ont été fixées après 3 jours avec du formaldéhyde à 2 % et dénombrées par coloration au cristal violet. Le poliovirus de type 1 Mahoney a été amplifié à partir d'un clone infectieux et amplifié dans des cellules HeLa. Le titre viral a été déterminé par dosage sur plaque sur des cellules HeLa, en utilisant une couche d'Avicel à 1,2 % (p/v) ; les plaques ont été fixées de la même manière et colorées pour le dénombrement après 2 jours.

Des organoïdes différenciés et apicaux (5 jours après la différenciation et l'inversion de polarité) ont été infectés par la souche EV-A71 4643. Comme les cellules RD sont très sensibles à l'infection par EV-A71, la multiplicité de l'infection telle que définie par les cellules RD correspond à une infection beaucoup plus clairsemée chez les organoïdes. Les organoïdes ont donc été exposés à une multiplicité élevée d'infection (MOI, 620 PFU par cellule) pour établir une infection dans laquelle cinq cellules ou moins ont été infectées par organoïde. Des organoïdes apicaux ont été préparés à partir de tissus coliques, gastriques et duodénaux et infectés par EV-A71. Entre ces trois tissus, les colonoïdes étaient les plus infectés (Fig. 1b et Extended Data Fig. 7).

Pour séparer les organoïdes en suspension des débris avant l'infection, les organoïdes ont été collectés dans un tube conique de 15 ml et laissés à sédimenter par gravité sur la paillasse (1 g) pendant 5 à 10 min. Le surnageant a été jeté et les organoïdes granulés ont été lavés une fois dans du DMEM. La granulation par gravité a entraîné une très faible contamination avec des cellules individuelles (données étendues Fig. 5 et tableau supplémentaire 4). Une aliquote de cette suspension organoïde a été prélevée, dissociée avec TrypLE Express et comptée sur le compteur de cellules Countess II (ThermoFisher) pour dénombrer les cellules en suspension organoïde pour les calculs de MOI. Pour les expériences dans lesquelles des infections en triple ont été réalisées, la suspension organoïde a été divisée en trois tubes coniques. Les organoïdes ont été granulés à 300 g pendant 3 min et remis en suspension dans un volume approprié de stock de virus (3, 7 × 108 PFU ml-1), transférés sur une plaque à attachement ultra-faible et incubés à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 2 h. Après incubation, les organoïdes ont été lavés trois fois dans du DMEM avec des centrifugations à 300 g pendant 3 min. Après le troisième lavage, les organoïdes ont été remis en suspension dans un milieu de différenciation chaud et plaqués dans des plaques de culture tissulaire à très faible attachement. Des traitements pharmacologiques ont ensuite été ajoutés le cas échéant. Les organoïdes infectés ont été incubés à 37 ° C avec 5% de CO2 jusqu'au point final expérimental. Dans les expériences au cours desquelles le titre viral global a été quantifié, la totalité de la suspension organoïde a été collectée et l'échantillon a été soumis à trois cycles répétés de congélation-décongélation pour lyser les cellules avant le test sur plaque.

Pour les expériences dans lesquelles des colonoïdes basolatéralement différenciés ont été infectés par EV-A71, les colonoïdes ont été cultivés pendant 5 jours dans un milieu de croissance et différenciés pendant 5 jours avant l'infection sans retrait de l'échafaudage de gel BME. Le jour de l'infection, les colonoïdes ont été retirés de la matrice BME polymérisée par une incubation de 40 min dans 5 mM d'EDTA. Après avoir lavé une fois avec du DMEM, les colonoïdes ont été remis en suspension dans un milieu de différenciation froid contenant l'inoculum EV-A71 (MOI 1 300 PFU par cellule), additionné de 20 % (v/v) de BME pour empêcher l'inversion de polarité dans la culture en suspension. Les colonoïdes en présence d'EV-A71 ont été étalés dans des plaques de culture tissulaire à attachement ultra-faible et incubés pendant 8 h à 37 ° C avec 5% de CO2 avant fixation.

Pour les infections à poliovirus, des organoïdes différenciés, apicaux de l'iléon et du côlon ont été infectés en utilisant la méthodologie décrite ci-dessus pour les infections à EV-A71. Les organoïdes de l'iléon ont été infectés à un MOI de 10 PFU par cellule et fixés à 22 hpi. Les organoïdes du côlon ont été infectés à un MOI de 1 PFU par cellule et fixés à 42 hpi.

Les organoïdes ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 2 % dans un tampon phosphate de sodium 100 mM (pH 7,4) pendant au moins 30 min et lavés avec du PBS. Les organoïdes ont été colorés en incubant avec des anticorps et/ou des colorants dans un tampon de blocage/perméabilisation (PBS avec 3 % d'albumine de sérum bovin, 1 % de saponine et 0,02 % d'azide de sodium) pendant une nuit sous agitation douce. Les organoïdes colorés ont été lavés trois fois dans du PBS et montés sur des lames de verre à l'aide d'un milieu de montage Vectashield (Vector Laboratories, H-1000), et des lamelles de verre ont été fixées à l'aide de graisse sous vide. Les organoïdes ont été imagés sur un microscope confocal LSM 700 (Carl Zeiss) avec le logiciel Zen 2009 (Carl Zeiss) à un grossissement de 40 × ou 63 × avec des objectifs à immersion dans l'huile. Des rendus 3D d'organoïdes ont été générés à l'aide du logiciel d'analyse d'images Volocity 3D (PerkinElmer version 5.3).

Les organoïdes ont été colorés avec du dichlorhydrate de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; Life Technologies, D1306) et de la phalloïdine Alexa Fluor 660 (Invitrogen, cat. No. A22285) pour visualiser les noyaux et l'actine. Les dilutions d'anticorps primaires ont été réalisées aux dilutions suivantes : Mouse anti-dsRNA IgG2a Kappa Chain Antibody (J2) SCICONS (acquis par Nordic MUbio) cat. Non. 10010200, RRID : AB_2651015 (1:500), Rabbit anti-LIMP2/SCARB2 Recombinant Monoclonal Antibody (22H6L14) ThermoFisher cat. Non. 703037 ; RRID : AB_2734813 (1:100), Rabbit anti-Muc2 Polyclonal Antibody (H-300) SCBT cat. Non. sc-15334 RRID : AB_2146667 (1:200) et anticorps de lapin anti-VIL1 IgG Sigma Aldrich cat. Non. HPA006885 ; RRID : AB_1080564 (1:100). Des dilutions d'anticorps secondaires ont été effectuées à une dilution de 1:500. Les anticorps secondaires suivants ont été utilisés : Goat anti-Mouse IgG (H + L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen cat. Non. A11001 ; RRID : AB_2534069 ; Chèvre anti-Lapin IgG (H + L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen cat. Non. A11008 ; RRID : AB_143165 ; Chèvre anti-souris IgG (H + L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen cat. Non. A21422; RRID : AB_2535844 ; Chèvre anti-souris IgG (H + L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen cat. Non. A11005 ; RRID : AB_2534073 ; Chèvre anti-Lapin IgG (H + L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen cat. Non. A11012 ; RRID : AB_2534079 ; Lapin anti-souris IgG (H + L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen cat. Non. A11059; RRID : AB_142495. Lorsque plusieurs anticorps secondaires ont été utilisés dans la même procédure de coloration organoïde, les anticorps secondaires utilisés ont été élevés dans la même espèce hôte (chèvre). Pour la visualisation de l'activité de la caspase 3/7, le réactif de détection vert CellEvent Caspase 3/7 (Invitrogen, C10723) a été ajouté aux organoïdes vivants à 10 µM après 24 h d'infection, puis les organoïdes ont été fixés à 48 hpi et colorés comme décrit ci-dessus. Des cellules individuelles qui avaient été entièrement extrudées à partir d'organoïdes ont été colorées et imagées de la même manière que les organoïdes intacts, comme décrit ci-dessus ; cependant, pour ces expériences, un objectif sec à grossissement 20× a été utilisé.

Les images d'organoïdes ont été visualisées à l'aide du logiciel d'analyse d'images Volocity 3D (PerkinElmer) pour obtenir une visualisation 3D de chaque organoïde. Les cellules des organoïdes considérées comme extrusives, apoptotiques et/ou infectées ont été comptées manuellement. Une cellule d'extrusion a été définie par une cellule attachée à un organoïde avec un noyau qui a traversé la bordure en brosse des microvillosités organoïdes. Dans les expériences nécessitant le comptage de toutes les cellules, le nombre total de cellules dans chaque organoïde a été dénombré par imagerie DAPI à des intervalles de pile z de 6 µm pour capturer les noyaux de chaque cellule organoïde dans un seul plan z. La volocité a été utilisée pour quantifier les noyaux individuels à partir de ces images individuelles du plan z à l'aide de la fonction de quantification des noyaux 2D.

Dans les expériences pertinentes, la quantification des cellules restantes non extrudées ou non infectées a été calculée en soustrayant le nombre de cellules comptées manuellement dans chaque groupe du nombre total de cellules dans chaque organoïde.

Dans des expériences où des cellules entièrement extrudées ont été examinées, des cellules individuelles ont été identifiées à partir de rendus 3D d'images avec des piles z à des intervalles de 1,8 µm. Le logiciel d'analyse d'images Volocity 3D (PerkinElmer) a été utilisé pour identifier les cellules individuelles : les noyaux ont d'abord été identifiés à l'aide de la fonction de quantification Find Objects, la surface de l'objet a été augmentée pour entourer chaque noyau à l'aide de la fonction de quantification Dilate Objects deux fois de manière itérative, et l'intensité du signal dans chaque canal a été capturée à l'aide de la fonction Measure Objects. Les objets avec une somme d'intensité dans le canal d'ARNv> 2 500 ont été considérés comme infectés.

Des composés pharmacologiques et des peptides ont été testés pour leur capacité à réduire l'extrusion de cellules infectées. Pour toutes les expériences, les organoïdes ont été exposés à des composés après les premières étapes d'inoculation virale et de lavage. Z-VAD-FMK (inhibiteur de pan-caspase, R&D Systems, 21631) et para-nitro-blebbistatin (inhibiteur de myosine II, Cayman Chemical, 24171) ont été solubilisés dans du DMSO anhydre et ajoutés aux organoïdes infectés à des concentrations finales de 100 µM et 50 µM, respectivement. GsMTx4 (inhibiteur de canal ionique mécanosensible, Tocris, 4912/100U) a été solubilisé dans un milieu de différenciation et ajouté aux organoïdes infectés à une concentration finale de 20 µM. Pour les expériences dans lesquelles tous les composés solubilisés dans le DMSO ont été inclus, les concentrations finales de DMSO dans les puits ont été standardisées dans toutes les conditions à 0,5 % (v/v).

Des fractionnements de suspensions d'organoïdes infectés par sédimentation différentielle ont été effectués après 8 h d'infection. Tous les échantillons ont été conservés à 4 °C pendant le fractionnement. Des échantillons de suspension organoïde entière (échantillons de puits entiers) ont été prélevés avant toute étape de sédimentation. Ensuite, les organoïdes ont été granulés par gravité (1g) pendant 10 à 15 min. Les échantillons ont été inspectés au microscope confocal pour confirmer la granulation des organoïdes. Les pastilles contenant des organoïdes intacts ont été lavées trois fois dans du DMEM et finalement remises en suspension dans du DMEM pour une analyse future (échantillons d'organoïdes). L'examen des organoïdes collectés a montré une contamination limitée par des cellules individuelles (données étendues Fig. 5 et tableau supplémentaire 4). Les surnageants contenant des cellules extrudées dans le milieu d'origine (échantillons Cells + Media) ont ensuite été centrifugés à 600 g pendant 3 min pour générer des échantillons Cells and Media. Les culots cellulaires ont été lavés de la même manière trois fois dans du DMEM et remis en suspension dans du DMEM pour une analyse future (échantillons de cellules); aucun organoïde n'a été observé dans ces préparations. Les surnageants de la centrifugation de 600 g ont également été collectés (échantillons de milieu). Dans des expériences avec un pic de virus exogène pour s'assurer que les étapes de lavage étaient suffisantes pour éliminer la contamination virale libre des fractions cellulaires, 106 PFU de stock de virus EV-A71 ont été ajoutés aux échantillons Cells + Media et les étapes de lavage se sont déroulées comme décrit ci-dessus. Toutes les fractions ont été soumises à trois cycles de congélation et de décongélation pour libérer le virus intracellulaire dans les fractions contenant des cellules ou des organoïdes avant la détermination des titres de virus par essai sur plaque.

Les cellules extrudées d'organoïdes infectés ont été collectées comme dans les expériences de fractionnement ci-dessus. Après la granulation par gravité pour éliminer les organoïdes, les cellules extrudées ont été passées à travers une passoire à mailles en nylon de 70 µm. Dans les cas où de petits organoïdes ont été observés traversant une passoire de 70 µm, ceux-ci ont été éliminés par une centrifugation supplémentaire de 10 g pendant 3 min. Au cours du troisième (dernier) lavage des cellules extrudées, un milieu de différenciation froid a été utilisé pour laver les cellules. Le surnageant de ce lavage a été conservé et utilisé comme inoculum sur des infections parallèles pour surveiller les niveaux de virus qui peuvent être le résultat d'une élimination incomplète du virus acellulaire. Le culot contenant les cellules extrudées a été remis en suspension dans un milieu de différenciation froid et immédiatement utilisé comme inoculum sur de nouvelles cellules ou organoïdes. Les cellules RD secondairement infectées ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits 1 à 2 jours avant l'infection, lavées une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec Ca + 2 et Mg + 2 (DPBS ++) immédiatement avant l'infection, inoculées pendant 1 h à 37 ° C avec 150 µl de surnageant de lavage ou de cellules extrudées, et lavées à nouveau avec DPBS ++ avant l'ajout de 1 ml par puits de milieu cellulaire RD. Le milieu cellulaire a été collecté et congelé à -20 ° C immédiatement après l'infection (1 h) ou après 16 h d'infection. Des infections secondaires d'organoïdes ont été réalisées en utilisant les méthodes décrites ci-dessus pour les infections EV-A71 d'organoïdes ; cependant, étant donné que l'utilisation immédiate de cellules extrudées comme inoculum a rendu impossible la quantification du titre viral des inoculums avant leur utilisation dans des infections secondaires, les cellules infectées secondairement n'ont pas été comptées pour la détermination de la MOI avant l'infection.

L'analyse des données statistiques a été effectuée dans GraphPad Prism 9. Sauf indication contraire, toutes les expériences ont été effectuées trois fois de manière indépendante en utilisant plusieurs lignées de donneurs organoïdes distincts pour tenir compte des différences spécifiques aux donneurs. Dans les expériences pour lesquelles les données d'une expérience représentative sont présentées, les résultats expérimentaux ont été reproduits à l'aide d'organoïdes provenant d'une lignée de donneurs supplémentaire. Toutes les images de microscopie présentées sont représentatives d'expériences dans lesquelles un minimum de dix organoïdes ont été interrogés avec des résultats similaires. Pour les données de microscopie quantitative dans le texte principal (Figs. 2d, e, 3f et 4f), trois expériences indépendantes portant chacune sur au moins dix organoïdes ont été réalisées ; les valeurs moyennes d'expériences indépendantes ont été utilisées pour les tests statistiques. Dans les graphiques de microscopie, les cercles représentent les mesures d'organoïdes individuels (répliques techniques) tandis que les triangles représentent les mesures obtenues en accumulant les données de tous les organoïdes de la même expérience (répliques biologiques). La couleur des symboles classe les expériences indépendantes. Ce format de graphique « SuperPlot » utilisé ici a été décrit en détail par Lord et al.59. Dans tous les graphiques, les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (sd). Des informations sur les tests statistiques spécifiques à chaque analyse peuvent être trouvées dans les légendes des figures. Pour les tests statistiques gaussiens utilisés, la distribution des données a été supposée normale, mais cela n'a pas été formellement testé. Les valeurs P exactes des tests statistiques peuvent être trouvées dans les fichiers de données source. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, mais nos tailles d'échantillon sont similaires à celles rapportées dans les publications précédentes9,10,13.

Dans chaque expérience indépendante, des échantillons (organoïdes) ont été assignés au hasard à des groupes expérimentaux. Pour réduire les possibilités d'erreur de l'opérateur, l'organisation des conditions expérimentales présentées (par exemple, la disposition des plaques) n'a pas été randomisée. La collecte des données sur les titres viraux (comptage des plaques) a été réalisée avec randomisation et avec mise en aveugle par l'investigateur des échantillons. En raison de la nature chronophage de la collecte des données de microscopie, la randomisation et la mise en aveugle n'ont pas été appliquées.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Aucun ensemble de données avec dépôt obligatoire n'a été généré dans cette étude. Toutes les données graphiques brutes et les tests statistiques associés ont été mis à disposition sous forme de fichiers de données sources. Les données sources sont fournies avec ce document. D'autres données qui appuient les résultats de cette étude, y compris les fichiers d'images de microscopie brutes, sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande.

Le code n'est pas applicable.

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Nous remercions J. Co, M. Margalef-Català et K.-F. Weng pour le partage d'expertise et de réactifs, C. Kuo (Université de Stanford) pour la généreuse fourniture de lignées cellulaires organoïdes, J. Theriot, M. Ott et B. Burkholder pour la discussion scientifique, et P. Sarnow et J. Carette pour la lecture critique du manuscrit. Les illustrations ont été créées sur Biorender.com. Ce travail a été soutenu par le Chan-Zuckerberg BioHub (KK), BioX de l'Université de Stanford (ARC), la subvention de la Fondation Novo Nordisk NNF19OC0056411 (MRA) et les subventions des National Institutes of Health R01AI13491204 (KK), 5U19AI116484-06 (MRA), T32GM007276 (JM) et T32AI1007328 (JM). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Ces auteurs ont supervisé conjointement ce travail : Manuel R. Amieva, Karla Kirkegaard.

Département de microbiologie et d'immunologie, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Jasmine Moshiri, Manuel R. Amieva et Karla Kirkegaard

Département de génétique, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Ailsa R. Craven, Sarah B. Mixon et Karla Kirkegaard

Département de pédiatrie, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Manuel R. Amieva

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JM a conçu, conçu et exécuté des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit original. KK a participé à la conception de la recherche proposée et à la conception d'expériences. ARC a contribué aux expériences des Fig. 1b et 5b – i et des expériences exécutées dans les Figs de données étendues. 2 et 7. SM a effectué une microscopie pour la Fig. 4 et la Fig. 3 pour les données étendues. KK et MRA ont conjointement supervisé la recherche et participé à l'interprétation des résultats. KK, MRA et JM ont acquis un financement. JM, KK et MRA ont édité et révisé le manuscrit.

Correspondance avec Karla Kirkegaard.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Nihal Altan-Bonnet, Stanley Perlman et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Des cellules infectées par le poliovirus de type 1 (Mahoney) ont été observées sortant d'organoïdes par immunofluorescence. ( ab ) Organoïdes du côlon infectés par un MOI = 1 PFU / cellule pendant 42 h. La MOI a été déterminée par titre viral sur des cellules HeLa. Les barres d'échelle sont égales à 10 μm.

Des colonoïdes différenciés avec une polarité organoïde basolatérale ont été infectés avec EV-A71 et visualisés par immunofluorescence 8 heures après l'infection. ( a ) Une forte coloration de la F-actine de la bordure en brosse des microvillosités apicales a été observée sur la lumière intérieure des colonoïdes infectés. Les cellules infectées par le virus peuvent être observées à la fois dans la couche épithéliale et dans la lumière apicale. ( b, c ) Les cellules infectées par EV-A71 ont été extrudées apicalement dans la lumière intérieure des colonoïdes basolatéralement sortis. Les barres d'échelle sont égales à 10 μm.

( a ) Les organoïdes infectés ont été fixés à des moments précis au cours du premier cycle d'infection et le nombre de cellules infectées et non infectées a été dénombré à l'aide de la microscopie à fluorescence. Chaque point représente la proportion de cellules infectées dans un organoïde individuel ; les triangles représentent les valeurs moyennes sur tous les organoïdes pour chaque point de temps. Une expérience avec N = 10 organoïdes quantifiés par point de temps. Un pic de la proportion de cellules infectées dans les organoïdes est apparu à 7 hpi et a été réduit après 9 hpi. Les nombres de cellules brutes représentés dans ce graphique sont affichés dans le tableau supplémentaire 2. (b–d) Cellules infectées représentatives de chaque point de temps. L'extrusion de cellules infectées contient un signal d'ARNv tout aussi abondant, quel que soit le moment visualisé. Les barres d'échelle sont égales à 10 μm.

Données source

Les cellules entièrement extrudées des colonoïdes infectés en présence du substrat fluorogène de la caspase 3/7 CellEvent ont été collectées à 48 hpi, fixées et examinées par microscopie à fluorescence à un grossissement de 20x. (a) Les rendus 3D des cellules imagées ont été visualisés à l'aide du logiciel d'analyse d'images Volocity. Les cellules infectées sont entourées de cases jaunes. ( b ) Des cellules individuelles ont été identifiées à partir de 20 champs de vision uniques comme dans A à l'aide d'outils de mesure informatiques dans Volocity. Les données ont été recueillies à partir de N = 743 cellules individuelles. Les cellules avec des intensités de pixel supérieures à 1,5 par micron cube dans le canal d'ARNv ont été identifiées comme infectées ; N = 39 cellules infectées, 5,2 % du total. ( c ) L'activité caspase 3/7 des cellules définies en B a été comparée. L'activité caspase dans les cellules infectées était comparable à celle des cellules non infectées ; test t bilatéral non apparié ; données présentées sous forme de moyenne ± SD ; N = 39 cellules infectées ; N = 704 cellules non infectées.

Données source

Après le fractionnement des cultures d'organoïdes, toutes les fractions ont été examinées visuellement sur un microscope de culture tissulaire pour évaluer la collecte des populations cibles. (a) L'examen visuel de la fraction organoïde à un grossissement de 40x confirme que les organoïdes sont collectés avec une pastille de gravité (1 xg). ( b ) Région mise en évidence dans A. Des cellules individuelles étaient également présentes à faible abondance dans la fraction organoïde (les flèches indiquent des exemples), potentiellement en raison de l'extrusion cellulaire en cours des organoïdes pendant le fractionnement (têtes de flèches).

Nous fournissons deux hypothèses pour les moyens potentiels d'activation des canaux ioniques mécanosensibles dans les cellules infectées qui peuvent entraîner l'extrusion des cellules infectées. Les canaux ioniques mécanosensibles tels que Piezo1 peuvent être activés par (a) des forces de compression externes qui induisent une déformation de la membrane, ainsi que (b) des forces mécaniques intrinsèques aux cellules transmises par des filaments cytosquelettiques attachés. (c, d) Nous présentons des modèles conceptuels sur la façon dont l'infection virale peut induire l'activation du canal via des forces extérieures-intérieures ou intrinsèques aux cellules. ( c ) Dans les cellules non infectées, les filaments du cytosquelette fournissent un support structurel sous la membrane plasmique, réduisant la déformation de la membrane due aux forces extrinsèques cellulaires. Dans les cellules infectées où l'actine est réarrangée, ce support structurel peut être absent, ce qui entraîne des membranes «plus molles» plus facilement déformées par les forces de compression externes. ( d ) Dans le modèle de force à travers le filament, les forces mécaniques intrinsèques à la cellule sont transmises aux canaux piézo-électriques via l'attache aux filaments du cytosquelette. Dans les cellules infectées, les réarrangements du cytosquelette peuvent transmettre des forces directement aux canaux Piezo attachés, induisant une activation. Adapté de "Canaux PIEZO : comment permettent-ils la mécanosensation ?", par BioRender.com (2022). Extrait de https://app.biorender.com/biorender-templates.

Des organoïdes épithéliaux différenciés apicaux dérivés de tissus humains (a) gastriques et (b) duodénaux ont été infectés par l'entérovirus A-71. Le titre viral a été surveillé au fil du temps par dosage sur plaque. Les données d'un donneur unique et d'une expérience par panel sont présentées en triple exemplaire technique. Les données représentées sont moyennes ± SD.

Données source

Tableaux supplémentaires 1 à 4.

Données sources statistiques.

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Réimpressions et autorisations

Moshiri, J., Craven, AR, Mixon, SB et al. Extrusion mécanosensible de cellules infectées par l'entérovirus A71 à partir d'organoïdes du côlon. Nat Microbiol 8, 629–639 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

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Reçu : 31 juillet 2022

Accepté : 10 février 2023

Publié: 13 mars 2023

Date d'émission : avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

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