La métatranscriptomique révèle la température

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 21871 (2016) Citer cet article

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Les fromages traditionnels abritent des consortiums microbiens complexes qui jouent un rôle important dans la formation des propriétés sensorielles typiques. Cependant, le métabolisme microbien est considéré comme difficile à contrôler. La succession de la communauté microbienne et l'expression des gènes associés ont été analysées au cours de l'affinage d'un fromage italien traditionnel, identifiant les paramètres qui pourraient être modifiés pour accélérer l'affinage. Ensuite, nous avons modulé les conditions de maturation et observé des changements constants dans la structure et la fonction de la communauté microbienne. Nous apportons des preuves concrètes de la contribution essentielle des bactéries lactiques non starter dans les activités liées à l'affinage. Une augmentation de la température d'affinage favorise l'expression de gènes liés à la protéolyse, la lipolyse et le catabolisme acides aminés/lipides et augmente significativement la vitesse de maturation du fromage. De plus, les métabolismes microbiens favorisés par la température étaient cohérents avec les profils métabolomiques des protéines et des composés organiques volatils dans le fromage. Les résultats indiquent clairement comment les réponses du microbiome induites par le traitement peuvent être modulées afin d'optimiser l'efficacité de la production et la qualité des produits.

Le fromage est une matrice biologiquement et biochimiquement dynamique, où la structure et l'activité du microbiote sont influencées par les pratiques de fabrication et les conditions environnementales. Les fromages traditionnels utilisent soit des ferments sélectionnés naturellement avec une grande diversité génétique, soit sans levain1,2. Ainsi, les fromages traditionnels abritent un microbiote riche et complexe, issu de l'utilisation de cultures de lactosérum naturel (NWC) indéfinies utilisées selon un procédé de backslopping, mais aussi du lait cru et de l'environnement laitier3, dont le rôle lors de la fabrication et de l'affinage est reconnu mais souvent sous-exploré. La fabrication du fromage est caractérisée par une succession de différentes espèces de bactéries lactiques (BL). L'acidification du caillé est principalement due aux bactéries lactiques thermophiles, principalement Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii et Lb. helveticus2,4,5, tandis que les LAB mésophiles non starter (NSLAB) prennent le relais lors de l'affinage et peuvent être impliqués dans le développement de la saveur et de la texture du fromage6,7,8,9,10,11. Le microbiote joue un rôle important dans la formation des propriétés sensorielles typiques du fromage12,13. Néanmoins, ces consortiums microbiens complexes sont souvent difficiles à contrôler et leur dynamique et leur évolution au cours de la fabrication et de l'affinage du fromage ne peuvent pas être facilement prédites. Comprendre le comportement microbien au cours de l'affinage du fromage et comment les paramètres technologiques appliqués peuvent influencer la dynamique de fabrication du fromage et la qualité du produit final, sont des étapes cruciales pour assurer la sécurité et la qualité3,14. De plus, l'accélération de la cinétique de maturation par la modulation des activités microbiennes peut être extrêmement importante pour les laiteries traditionnelles, à petite échelle et plus industrialisées. Avec ce contrôle, ils peuvent réduire les coûts d'exploitation, augmenter le chiffre d'affaires des chambres d'affinage et optimiser l'efficacité du processus en donnant la priorité à la qualité du fromage. L'étude de l'écologie microbienne dynamique et du métabolisme pendant la fabrication du fromage à l'aide d'approches multi-omiques peut aider à améliorer l'efficacité14,15. La métatranscriptomique a été récemment utilisée pour étudier des cultures de souches inoculées dans des fromages modèles16,17, mais la dynamique des transcriptions de communautés complexes reste inexplorée. D'autre part, les communautés microbiennes des aliments fermentés ne sont pas aussi complexes que celles d'autres environnements naturels et peuvent constituer un système reproductible et traitable pour étudier la dynamique de l'assemblage microbien et la façon dont elles peuvent être manipulées par des facteurs abiotiques18.

La caractérisation longitudinale de la structure de la communauté microbienne et de l'expression des gènes a été réalisée pendant l'affinage du fromage traditionnel italien Caciocavallo Silano. Il s'agit d'un fromage typique à pâte filée d'affinage moyen produit avec l'ajout de NWC comme levain naturel. L'enquête initiale, rapportée ici, a identifié des paramètres qui pourraient être modifiés pour accélérer la maturation. Par conséquent, nous avons mis en place une deuxième expérience, dans laquelle les conditions de maturation ont été modulées et des changements cohérents dans la structure et la fonction de la communauté microbienne ont été observés. Nous révélons comment l'augmentation de la température d'affinage affecte le métabolisme microbien, ce qui augmente considérablement le taux de maturation du fromage.

L'affinage du fromage a été exploré dans deux expériences distinctes. Dans un premier temps, une analyse de la structure de la communauté microbienne (amplicon d'ARNr 16S) et une exploration superficielle de l'expression des gènes (métatranscriptomique) ont été réalisées sur du lait de vache cru et thermisé, une culture de lactosérum naturel, du caillé après 5 heures de fermentation et avant étirage, des fromages après saumurage et pendant la maturation à 0, 10, 20, 30 et 60 jours. De cette manière, nous avons identifié quelles activités/voies bactériennes étaient fortement exprimées lors de la production et de l'affinage d'un fromage à pâte filée, ce qui a fourni les paramètres nécessaires pour comprendre comment accélérer l'affinage.

Ensuite, nous avons mis en place une deuxième expérience, caractérisant le microbiome sur 30 jours, pour des fromages affinés dans trois conditions différentes : (A) conditions standard en laiterie (16 °C et 75 % HR), (B) augmentation de la température à 20 °C et (C) diminuant l'humidité relative à 65 %.

Nous avons obtenu un total de 3,3 Gbp dans la première expérience et de 19,8 Gbp dans la seconde expérience. Dans la première expérience, une moyenne de 876 295 lectures/échantillon (± 409 657) ont été obtenues et une moyenne de 22 % de lectures cartographiées de manière unique sur les génomes de référence (allant de 12 à 27,8 %).

Dans la deuxième expérience, nous avons obtenu une moyenne de 1 180 7044 lectures/échantillon (± 5,9 millions) et une moyenne de 35,5 % de lectures cartographiées de manière unique sur les génomes de référence (allant de 23,9 à 58,6 %). L'abondance normalisée (lectures par million) des gènes identifiés pour chaque espèce et l'abondance relative de l'OTU (%) sont indiquées dans les tableaux supplémentaires S1 et S2.

L'affinage du fromage a été conduit par quelques lactobacilles non starter, par exemple Lb. casei et Lb. buchneri, groupes dont l'abondance était plus importante dans le cœur du fromage que dans la croûte. Ce résultat était cohérent dans les deux expériences menées dans cette étude. Les firmicutes étaient le phylum qui différenciait le plus significativement le microbiote du noyau et de la croûte (Fig. 1 supplémentaire). Les charges microbiennes sur la gélose MRS incubée à 30 ° C ont augmenté au cours de l'affinage, avec des valeurs plus élevées dans le noyau du fromage, tandis que les lactobacilles thermophiles et les streptocoques ont progressivement diminué (tableau supplémentaire 3). Lorsque nous avons comparé trois conditions d'affinage différentes (deuxième expérience), les NSLAB à 10 jours d'affinage étaient significativement plus abondants lorsque l'humidité relative était réduite (C - 17,2%) et lorsque la température d'affinage était augmentée (B - 15,3%) par rapport aux conditions témoins. (A–8,3 %) (P < 0,05). Cependant, dans la condition d'humidité relative réduite (C), l'abondance de NSLAB a rapidement diminué après 10 jours de maturation. Fait intéressant, Lb. fermentum, qui n'a pas été détecté dans la condition témoin, est apparu dans la condition de température élevée (B) après 10 jours et a continué à augmenter en abondance tout au long de la maturation.

Les résultats de la première expérience ont montré que le caillé et le fromage après moulage et saumurage étaient caractérisés par la prévalence de gènes impliqués dans le métabolisme des glucides. Au cours de l'affinage, le métabolisme des glucides (voie des pentoses-phosphates, glycolyse) et la division cellulaire (traitement de l'information génétique et processus cellulaires centraux) ont été enrichis sur les croûtes de fromage, tandis que les noyaux de fromage ont été caractérisés par un métabolisme des acides aminés et des lipides significativement élevé (Fig. 1) . De plus, les échantillons mûris à une température plus élevée (B) au cours de la deuxième expérience ont montré une augmentation de l'expression des voies liées au métabolisme des acides aminés et des lipides (Fig. 2a) et des gènes associés (Fig. 2b) par rapport au témoin (A) aux mêmes temps de maturation. Les gènes liés à la voie de Leloir de dégradation du galactose étaient surexprimés par rapport à la voie du tagatose-6-phosphate. Les enzymes responsables de la dégradation du lactose (lacZ, EC 3.2.1.23 et lacG, EC 3.2.1.85), les voies de Leloir et du tagatose ont montré une expression maximale aux premiers stades de la fabrication et ont diminué pendant la maturation (Fig. 2 supplémentaire). Les enzymes conduisant à la production d'acétoïne et de diacétyle étaient régulées à la hausse sur la croûte et avaient une expression significativement plus élevée à température plus élevée (B par rapport à A; Fig. 3 supplémentaire). De plus, un certain nombre de peptidases, de perméases d'acides aminés et de peptides, de lipases et de gènes impliqués dans le catabolisme des acides aminés et la β-oxydation des acides gras étaient surexprimés dans le cœur des fromages affinés à plus haute température (Fig. 2b et Tableau supplémentaire 4) . Enfin, une température plus élevée a stimulé l'expression de gènes impliqués dans la biosynthèse des acides gras à partir du pyruvate (Fig. 3). L'analyse DESeq a identifié 651 gènes différentiellement exprimés entre les noyaux de fromages affinés en condition A et B (valeur P < 0,05) quel que soit le temps d'affinage (tableau complémentaire 4). Parmi eux, les protéases, les peptidases, les transporteurs dipeptidiques, les perméases d'acides aminés, les gènes de catabolisme des acides aminés, la β-oxydation et la biosynthèse des acides gras étaient surexprimés dans le noyau des échantillons B par rapport à A (tableau supplémentaire 4).

Le métatranscriptome entraîne la séparation du cœur et de la croûte du fromage.

ACP basée sur l'abondance des annotations KEGG au niveau 2 de la hiérarchie des échantillons de cœur et de croûte de fromage de la première expérience réalisée dans cette étude. La première composante (horizontale) représente 65,7 % de la variance et la deuxième composante (verticale) représente 12,2 %. CO, échantillons de noyau de fromage ; CR, échantillons de croûte de fromage.

Une température plus élevée favorise l'expression des gènes liés à la maturation.

Regroupement par liaison moyenne des échantillons de la deuxième expérience basé sur la distance euclidienne de la proportion des voies KEGG (en haut) ou des gènes (en bas) appartenant aux métabolismes des glucides (violet), des acides aminés (orange) et des lipides (cyan). La barre de colonne est codée par couleur comme suit : rouge, fromage à t0 ; bleu, fromage affiné dans des conditions standard, vert, fromage affiné à haute température. L'échelle de couleurs représente l'abondance à l'échelle de chaque variable, désignée sous le nom de Z-score, le rouge indiquant une forte abondance et le bleu une faible abondance. Dans les identifiants des échantillons, la première partie indique le temps d'affinage (de t0, fromage après saumurage et séchage, à 30 jours d'affinage) ; CO, noyau ou CR, croûte ; A, maturation dans des conditions standard ; B, température plus élevée.

Voies menant à la production d'acides gras à partir d'acides aminés.

Biosynthèse des acides gras à partir du pyruvate (A) et du catabolisme des acides aminés ramifiés (B). Seuls les gènes KEGG identifiés dans les échantillons analysés sont rapportés et leur abondance est indiquée dans le diagramme thermique (C). Le regroupement de liaison moyenne est basé sur la distance de Spearman de la proportion des gènes KEGG. Seuls les échantillons de la deuxième expérience sont présentés. La barre de colonne est codée par couleur comme suit : rouge, fromage à t0 ; bleu, fromage affiné dans des conditions standard ; vert, fromage affiné à plus haute température. L'échelle de couleurs représente l'abondance à l'échelle de chaque variable, désignée sous le nom de Z-score, le rouge indiquant une forte abondance et le bleu une faible abondance. Dans les identifiants des échantillons, la première partie indique le temps d'affinage (de t0, fromage après saumurage et séchage, à 30 jours d'affinage) ; CO, noyau ou CR, croûte ; A, maturation dans des conditions standard ; B, température plus élevée. * Le malonyl-CoA peut être remplacé par du propanoyl-CoA, ce qui donne des acides gras à chaîne impaire. **Pour chaque cycle, 2 atomes de carbone sont ajoutés.

L'expression du métabolisme des acides aminés était principalement associée aux Firmicutes, suggérant un effet clair de la température sur le métabolisme de ce phylum (Fig. 4). Plus précisément, l'expression du métabolisme des acides aminés de Lb. casei semblaient être significativement augmentés sous la température élevée. Cependant, d'autres taxons NSLAB (tels que Lb. buchneri, Lb. plantarum, Lb. gasseri, Lb. fermentum, Lb. rhamnosus, Leuconostoc kimchii, Leuc. mesenteroides, Leuc. citreum, Pediococcus pentosaceus) ont également montré une activité accrue du métabolisme des acides aminés à la température plus élevée. Un réseau montrant des corrélations de Spearman significatives (FDR < 0,05) entre les gènes KEGG, les OTU et le métabolome suggère clairement que l'abondance de NSLAB était positivement corrélée aux gènes impliqués dans le métabolisme des acides aminés et des acides gras, ainsi qu'à l'abondance des composés volatils, la lipolyse et indices de protéolyse (Fig. 5). De plus, les activités associées à la maturation étaient inversement liées à l'abondance de LAB thermophiles provenant du levain naturel (Fig. 5).

Une température plus élevée stimule le métabolisme des acides aminés NSLAB.

Affectation taxonomique des gènes appartenant au métabolisme des acides aminés KEGG dans les échantillons de noyau de fromage de la deuxième expérience, à 30 jours d'affinage. Seules les espèces appartenant aux Firmicutes sont signalées. A, maturation dans des conditions standard ; B, température plus élevée.

L'abondance de NSLAB, l'expression des gènes liés à la maturation et le métabolome sont fortement liés.

Réseau montrant des corrélations de Spearman significatives (FDR < 0,1) entre les gènes KEGG appartenant au métabolisme des acides aminés et des lipides, les COV, les indices de lipolyse et de protéolyse et les OTU appartenant aux Firmicutes identifiés par séquençage de l'ARNr 16S. La taille des nœuds a été rendue proportionnelle au nombre de corrélations significatives. La couleur des bords indique des corrélations négatives (bleu) ou positives (gris). La couleur des nœuds a été attribuée comme suit : vert, gènes KEGG liés au métabolisme des acides aminés ; rouge, gènes KEGG liés au métabolisme des lipides ; jaune, COV ; magenta, indices chimiques ; cyan, UTO Firmicutes.

La température d'affinage plus élevée a également favorisé le développement de composés aromatiques, à la fois dans le cœur du fromage et sur la croûte (tableau 1). Les profils métabolomiques étaient très cohérents avec les profils d'expression de l'analyse métatranscriptomique. Les acides gras volatils à chaîne courte (acides butanoïque, pentanoïque, hexanoïque, heptanoïque, octanoïque et décanoïque) étaient les composés volatils les plus abondants, avec les 2-méthylcétones et les composés alcooliques, tels que l'hexanol, le 2-heptanol, le 1-butanol et le 3- méthyl butanol. Les méthylcétones, les alcools secondaires et les acides gras libres ont augmenté en abondance pendant la maturation et ont été élevés à la température plus élevée, ce qui a également été observé pour le 3-méthylbutanol (P < 0,05). Les acides gras libres peuvent provenir de la lipolyse directe des triacylglycérols, ou ils peuvent être synthétisés ex-novo à partir du pyruvate issu du catabolisme des acides aminés (Fig. 3). Les indices de lipolyse et de protéolyse étaient plus élevés dans le cœur et augmentaient dans le fromage affiné à plus haute température (tableau 1). En conséquence, l'analyse LC/MS de la fraction d'azote insoluble à pH 4,6 a montré une dégradation importante de l'αs1- et de la β-caséine dans le fromage affiné à température plus élevée, tandis que la fraction soluble à pH 4,6 a montré une plus grande quantité de peptides solubles dérivés de la deux protéines (Fig. 4 supplémentaire).

Le processus d'affinage du fromage est très complexe et implique des changements microbiologiques et biochimiques conduisant au développement d'une saveur et d'une texture spécifiques. Le microbiome du fromage est façonné par les facteurs abiotiques rencontrés lors de l'affinage (pH, aw, concentration en NaCl, disponibilité en O2). Par conséquent, différentes dynamiques peuvent se produire dans le cœur et la croûte du fromage, en raison des différentes conditions environnementales3,19. L'importance des activités métaboliques associées aux champignons et aux bactéries dans les fromages affinés en surface a été récemment mise en évidence16,17,20, alors qu'une augmentation du NSLAB dans les fromages affinés a été précédemment observée7,10. Les NSLAB sont connus comme protéolytiques21,22,23 et il a été démontré que le complément de cultures sélectionnées augmentait les niveaux de protéolyse8,24,25, suggérant qu'ils pourraient jouer un rôle clé pendant l'affinage du fromage. Nous apportons des preuves concrètes de leur contribution essentielle, montrant qu'une structure et une fonctionnalité différentes du microbiome évoluent dans le cœur et la croûte du fromage et que l'affinage se déroule avec un gradient partant du cœur vers la croûte, entraîné par la succession NSLAB. À la surface du fromage, où une aw plus faible et des concentrations d'O2 plus élevées rendent l'environnement défavorable, le développement des NSLAB est retardé et le métabolisme cellulaire est orienté vers la multiplication et la production d'énergie à partir des glucides. De manière constante, la dégradation du lactose et le métabolisme du galactose ont été retardés sur la croûte du fromage et leurs niveaux ont été maintenus constamment plus élevés sur la croûte par rapport au cœur. De plus, les activités microbiennes sont fortement influencées par les conditions appliquées lors de la maturation. Nous ne pouvons pas lier exclusivement les niveaux de protéolyse plus élevés à l'activité bactérienne et les enzymes endogènes peuvent être encore actives dans le fromage sans étape de cuisson du caillé. Cependant, une contribution bactérienne claire aux activités de maturation est étayée par la cohérence entre les données du métatranscriptome et du métabolome et par le degré significatif de corrélation entre l'apparition de NSLAB, les profils d'expression et les schémas métaboliques (Fig. 5). En particulier, l'expression génique bactérienne des activités associées à la maturation est significativement liée aux profils des métabolites et aux indices de protéolyse et de lipolyse.

L'augmentation de la protéolyse, de la lipolyse et du catabolisme des acides aminés/acides gras boostée par la température plus élevée a définitivement favorisé la production de composés volatils. Les acides gras libres observés peuvent provenir de la lipolyse directe des triacylglycérols, ainsi que de la biosynthèse ex novo à partir du pyruvate produit par le catabolisme des acides aminés26. De plus, le 3-méthylbutanol est produit par la dégradation de la leucine et les méthylcétones et les alcools secondaires proviennent du catabolisme des acides gras27,28.

Récemment, l'importance d'explorer les mécanismes d'assemblage microbien dans les aliments fermentés (MCoFF) a été soulignée18. Les aliments fermentés offrent des opportunités alléchantes pour étudier les schémas métaboliques microbiens et la dynamique écologique, en identifiant les principaux moteurs et en testant des hypothèses qui peuvent être facilement extrapolées à des environnements plus complexes18. Nous donnons un exemple clair de la façon dont ils pourraient être utilisés pour comprendre l'effet des facteurs abiotiques sur l'assemblage et le métabolisme de la communauté microbienne. Cela soutient le potentiel de modélisation de la dynamique des communautés microbiennes dans des environnements plus complexes18.

L'augmentation de la température d'affinage favorise l'expression de gènes liés à la protéolyse et au transport et au catabolisme des acides aminés/lipides, entraînant une concentration plus élevée d'acides aminés libres et d'acides gras et stimulant la production de COV généralement présents dans le volatilome du fromage Caciocavallo7, accélérant éventuellement la l'affinage et l'amélioration de l'impact potentiel de la saveur du fromage. En effet, les fromages affinés à température plus élevée pendant seulement 20 jours avaient des profils transcriptomiques très similaires à ceux affinés plus longtemps à température standard, indiquant que l'activité liée à l'affinage est stimulée par le changement des conditions d'affinage. Enfin, l'attribution taxonomique des gènes liés aux voies du métabolisme des acides aminés KEGG a confirmé un changement dans le métabolisme des acides aminés dû à la température plus élevée et a souligné le rôle des NSLAB en tant qu'acteurs fondamentaux dans la maturation des fromages.

Les résultats indiquent clairement à quel point les changements dans les conditions d'affinage sont importants pour manipuler le microbiome du fromage et ses activités et que la réponse du microbiome peut être rapidement utilisée pour améliorer les conditions de transformation et la qualité du produit.

La fabrication et l'affinage du fromage ont été effectués dans une laiterie située dans le sud de l'Italie et produisant du fromage Caciocavallo Silano bénéficiant de l'Appellation d'Origine Protégée (AOP, CE Reg. 1263/96). Dans une première expérience, lait de vache cru et thermisé, NWC, caillé après 5 h de fermentation et avant étirage (lorsque le pH atteint environ 5,25), fromages après moulage, après saumurage et pendant l'affinage (à 10, 20, 30 et 60 jours) ont été collectés et analysés par séquençage d'ARNr 16S et ARN-seq (tableau supplémentaire 5). Dans une deuxième expérimentation, afin d'évaluer l'effet des paramètres d'affinage sur le microbiome, nous avons décidé d'affiner les fromages d'une même fabrication dans trois conditions différentes : un affinage témoin (A) en utilisant les conditions standards en laiterie (16° C et 75 % HR, condition A), en augmentant la température à 20 °C (B) ou en diminuant l'HR à 65 % (C). Dans cette deuxième expérience, les fromages affinés ont été collectés jusqu'à 30 jours. Les ID d'échantillon indiqués dans le tableau supplémentaire 5 et dans tout le texte et les chiffres ont été attribués comme suit : la première partie de l'ID indique le moment de l'affinage (de t0, fromage après saumurage et séchage, à 60 jours d'affinage) ; CO, noyau ou CR, croûte ; A, maturation dans des conditions standard, B, maturation à température plus élevée, C, maturation à faible HR.

L'activité de l'eau (aw) a été mesurée en utilisant un instrument HygroPalm23-AW (Rotronic AG, Basserdorf).

Des échantillons du noyau (la partie interne, collectée au milieu du fromage) et de la croûte (la partie externe, après épluchage de la couche externe) ont été découpés (en tranches d'environ 0,5 cm d'épaisseur) dans des conditions stériles et analysés séparément. Différentes aliquotes de chaque échantillon ont été prélevées dans des sacs en plastique stériles pour les différentes analyses et transportées au laboratoire dans des conditions réfrigérées (4 °C). RNAlater (Ambion, Foster City, Californie) a été ajouté dans un rapport de 1: 6 à l'aliquote à utiliser pour l'extraction d'ARN avant le transport. Les échantillons ont été stockés à -80 ° C avant les analyses, à l'exception des comptages microbiens, qui ont été effectués dans les 2 h suivant l'échantillonnage, comme suit.

Vingt-cinq grammes (solide) ou 25 ml (liquide) d'échantillon à chaque moment de prélèvement et dans chaque condition d'affinage ont été homogénéisés dans 225 ml de solution de Ringer au quart (Oxoid, Milan, Italie) pendant 2 min dans un stomacher ( LAB Blender 400) en utilisant des sacs Stomacher Sto-Circul-Bag (tous deux de PBI, Milan, Italie) à température ambiante. Des dilutions décimales dans une solution de Ringer au quart ont été préparées et des aliquotes de 1 ml des dilutions appropriées ont été inoculées en triple exemplaire dans de la gélose M17 ou MRS (Oxoid, Milan, Italie) et incubées respectivement en aérobiose et en anaérobiose à 30 ou 42 °C pendant 48 h pour obtenir le nombre viable de streptocoques ou de lactobacilles mésophiles et thermophiles. Les résultats ont été calculés comme la moyenne du log des unités formant colonies (UFC)/g pour trois déterminations indépendantes.

Les échantillons stockés dans l'ARN ont ensuite été homogénéisés et 10 ml du mélange ont été centrifugés pendant 10 min à 4 ° C (12 000 × g). Deux répliques biologiques (deux fromages différents à chaque point d'échantillonnage et pour chaque condition) ont été soumises à une extraction d'ARN et l'ARN total a été regroupé avant un traitement ultérieur. Le culot a été lavé deux fois dans du PBS (Phosphate-Buffered Saline, pH 7,4) et l'extraction de l'ARN a été réalisée en double en utilisant le kit PowerMicrobiome RNA Isolation (MoBio, Carlsbad, Californie). L'ADN a été éliminé par un traitement avec TURBO-DNase (Ambion, Foster City, Californie) pendant 3 h à 37 ° C. L'absence d'ADN a été vérifiée par PCR et le traitement répété si nécessaire. La qualité de l'ARN a été contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose et par le bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, Californie). Le kit Qubit et le kit Qubit RNA Assay (Life Technologies, Carlsbad, Californie) ont été utilisés pour la quantification.

L'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie), à partir de 200 ng d'ARN total. La diversité microbienne a été étudiée par pyroséquençage de la région amplifiée V1-V3 de l'ARNr 16S comme rapporté ailleurs29. Les conditions de PCR, la préparation de la bibliothèque et le séquençage ont été réalisés comme récemment décrit30.

Le métatranscriptome a été étudié pour tous les échantillons de la première expérience et pour des échantillons sélectionnés pour la deuxième expérience (tableau supplémentaire 3). Deux répliques ont été séquencées pour tous les échantillons (chaque réplique a été obtenue en regroupant l'ARN extrait de deux fromages différents). L'ARN ribosomal (ARNr) a été appauvri en utilisant le kit magnétique Ribo-Zero (Epicentre, Charlotte, Caroline du Nord) et l'ARN enrichi en ARNm a été purifié par Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter, Milan, Italie) conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, la préparation de la bibliothèque et le multiplexage des échantillons ont été effectués à l'aide du kit de préparation de bibliothèque ScriptSeq v2 RNA-Seq (Epicentre, Charlotte, Caroline du Nord) (taille de l'insert d'environ 300 pb). La qualité de la bibliothèque a été vérifiée par 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, Californie). Le séquençage a été effectué sur un séquenceur Next Seq 500 avec le kit Mid Output (tous deux d'Illumina, San Diego, Californie), donnant des lectures à une extrémité unique de 150 pb.

Les lectures d'amplicons d'ARNr 16S ont été analysées à l'aide du logiciel QIIME 1.9.031, comme indiqué précédemment30. Les OTU définies par 99 % de similarité ont été sélectionnées à l'aide du pipeline uclust32 et les séquences représentatives ont été soumises au classificateur RDPII33 pour obtenir l'attribution de la taxonomie et l'abondance relative de chaque OTU à l'aide de la base de données des gènes ARNr 16S de Greengenes34.

L'ensemble de l'analyse des données du métatranscriptome a été réalisée comme suit : la qualité des lectures brutes (scores Phred) a été évaluée à l'aide de la boîte à outils FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). La contamination de l'adaptateur et de l'amorce a été éliminée avec CutAdapt35. Ensuite, les bases de faible qualité (score Phred <20) ont été coupées et les lectures inférieures à 60 pb ont été éliminées avec le logiciel SolexaQA++36. Les lectures ont été alignées sur une base de données de référence en utilisant Bowtie237 en mode sensible de bout en bout. La base de données utilisée a été construite en téléchargeant les parties codant pour les protéines des génomes (fichiers .ffn) de la base de données NCBI RefSeq (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ASSEMBLY_BACTERIA/) et de http://patricbrc .org/portail/. Les espèces incluses ont été choisies en fonction des résultats de séquençage 16S et de la sélection d'espèces couramment trouvées dans les écosystèmes alimentaires (énumérées dans le tableau supplémentaire 6). Comme nous n'avons pas effectué de métagénomique et que nous ne disposions pas des génomes de souches directement isolés de ces échantillons, tous les génomes séquencés disponibles ont été inclus. Les fichiers .ffn concaténés ont été alignés sur la base de données Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)38 version avril 2011 en utilisant mblastx39 afin d'obtenir l'annotation fonctionnelle et la taxonomie des gènes. Le nombre de lectures mappées de manière unique sur chaque gène de la base de données a été extrait à l'aide de SAMtools40 et normalisé en fonction de la taille de la bibliothèque à l'aide de scripts personnalisés construits sous l'environnement R (www.r-project.org). Seuls les gènes auxquels au moins 5 lectures/échantillon ont été cartographiés ont été conservés pour des analyses ultérieures. L'analyse statistique et le tracé ont été effectués dans l'environnement R. L'analyse différentielle de l'expression génique a été effectuée à l'aide du package Bioconductor DESeq41. Les valeurs de p ont été ajustées pour des tests multiples en utilisant la procédure de Benjamini-Hochberg42 et un taux de fausses découvertes (FDR) <0,05 considéré comme significatif. Les corrélations de Pairwise Spearman entre les OTU, les gènes KEGG, les composés organiques volatils et les indices biochimiques ont été calculées à l'aide du package R psych et les corrélations significatives (FDR <0,05) ont été tracées dans un réseau corrélatif à l'aide de Cytoscape v. 2.8.143. L'analyse en composantes principales (ACP) et le regroupement hiérarchique ont été effectués en utilisant le package made4 dans R. Tous les résultats sont rapportés sous forme de valeurs moyennes de deux répétitions.

L'extraction des composés volatils a été réalisée selon Lee et al.44. Le fromage congelé a été finement râpé et 25 g ont été transférés dans une bouteille de 100 mL, avec 25 mL d'eau déionisée, 50 μL de 2-méthyl-3-hepténone (pureté à 99 %, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) comme solution interne. standard (950 mg L-1) et 12,5 g de phosphate de sodium (NaH2PO4). La bouteille a été maintenue à 50 °C pendant 10 min dans un bain-marie pour faire fondre le fromage. Ensuite, le fromage fondu a été agité magnétiquement pendant 20 min à 50 ° C pour accélérer l'équilibre des composés volatils dans l'espace de tête. La fibre SPME (50/30 μm d'épaisseur divinyl-benzène/carboxène/polydiméthylsiloxane, 2 cm; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) a été insérée à travers un septum en téflon dans la bouteille et exposée à l'espace de tête de l'échantillon pendant 30 min à 40 ° C pendant l'agitation. Le même type de fibre s'est avéré très efficace pour l'analyse de l'arôme du fromage45. Les composés volatils ont été analysés par GC couplé à un spectromètre de masse à l'aide d'un GC/MS Hewlett-Packard 6890N (Agilent Technologies, Palo Alto, Californie) équipé d'une colonne capillaire J&W HP-5MS (30 m × 0,25 mm id × 0, 25 μm d'épaisseur de film ; J&W Scientific, Folsom, Californie). La température a été fixée à 40 °C pendant 2 min et augmentée de 40 à 160 °C à la vitesse de 6 °C/min et de 160 à 210 °C min-1 à 10 °C min-1. L'injecteur a été maintenu à 250 °C. L'hélium a été utilisé comme gaz porteur (0,9 mL min-1). Les spectres de masse ont été enregistrés à 70 eV. La température de la source était de 230 °C et la température de l'interface était de 250 °C. La désorption thermique des composés volatils a été réalisée en exposant la fibre SPME dans l'injecteur pendant 10 min. L'identification des composés a été réalisée en comparant les temps de rétention et les spectres de masse avec ceux des composés de référence purs dans les mêmes conditions et avec ceux de la base de données NIST. Avant utilisation, la fibre a été conditionnée à 270 °C pendant 1 h. Un test à blanc a été réalisé avant chaque analyse pour éviter le relargage de composés indésirables. L'analyse quantitative a été réalisée en normalisant l'aire du pic de chaque composé par rapport à l'aire du pic de l'étalon interne. Les zones de pic ont été traitées par le logiciel Chemstation (Agilent Technologies, Palo Alto, Californie). L'analyse a été réalisée en triple.

Des différences significatives entre les différents échantillons ont été déterminées pour chaque composé par une analyse statistique ANOVA unidirectionnelle. Le test de Tukey a été utilisé pour discriminer les moyennes des variables. Les différences avec P < 0,05 ont été considérées comme significatives. L'élaboration des données a été réalisée à l'aide de XLStat (version 2009.03.02), un progiciel complémentaire pour Microsoft Excel (Addinsoft Corp., Paris, France).

Du fromage râpé (5 g) a été dispersé dans 100 ml de tampon citrate de sodium 0,4 M (pH 8,0) préalablement chauffé à 40 °C et homogénéisé pendant 1 min avec un appareil Ultra-Turrax (Ultra-Turrax modèle T25, Ika Labortechnik, Staufen, Allemagne ). Le degré d'hydrolyse (DH) a été déterminé avec la méthode de l'acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique, selon Hermanson46 avec les modifications rapportées par Picariello et al.47. Pour l'analyse LC-MS, le pH de la fraction soluble dans le citrate a été ajusté à 4,6. La suspension résultante a été centrifugée pendant 10 min à 3000 g, la couche de graisse a été retirée et les fractions insolubles et solubles ont été séparées. Les deux fractions ont ensuite été analysées par LC/ESI-Q/TOF MS/MS à l'aide d'un spectromètre de masse hybride Q TOF Ultima (Waters, Manchester, UK), équipé d'une source ESI et fonctionnant en mode ions positifs, comme indiqué précédemment48.

L'indice de lipolyse a été exprimé comme la quantité de KOH (en mg) nécessaire pour neutraliser les acides gras libres contenus dans 1 g d'échantillon. Vingt grammes de chaque échantillon congelé ont été finement râpés et trois grammes de fromage râpé ont été incubés pendant 30 min avec 50 ml d'éthanol/éther diéthylique (1:1 v/v) sous agitation, afin d'extraire la graisse. La suspension a été filtrée sur papier Watman n° 42 et l'acidité du filtrat a été mesurée par titrage comme décrit par Dugat-Bony et al.16. Chaque échantillon a été analysé en triple exemplaire.

Les séquences d'ARNr 16S et de métatranscriptome sont disponibles au Sequence Read Archive (SRA) du National Center for Biotechnology Information (NCBI) sous les numéros d'accès SRP061555 et SRP061556, respectivement.

Comment citer cet article : De Filippis, F. et al. La métatranscriptomique révèle des changements fonctionnels liés à la température dans le microbiome ayant un impact sur le taux de maturation du fromage. Sci. Rep. 6, 21871; doi : 10.1038/srep21871 (2016).

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FDF a été soutenu par une subvention de la Région Campanie dans le cadre du programme "POR CAMPANIA FSE 2007/2013" - projet CARINA (Sécurité, durabilité et compétitivité de la production agro-alimentaire en Campanie) - CUP B25B09000080007. Nous tenons à remercier la laiterie Campolongo Srl, Montesano Sulla Marcellana – Italie pour avoir fourni les échantillons pour cette étude.

Département des sciences agricoles, Université de Naples Federico II, Via Università 100, Portici, 80055, Italie

Francesca De Filippis, Alessandro Genovese, Pasquale Ferranti & Danilo Ercolini

Division des biosciences (BIO), Argonne National Laboratory, Argonne, Illinois, États-Unis

Jack A.Gilbert

Département d'écologie et d'évolution, Université de Chicago, Chicago, Illinois, États-Unis

Jack A.Gilbert

Département de chirurgie, Université de Chicago, Chicago, Illinois, États-Unis

Jack A.Gilbert

Institute for Genomic and Systems Biology, Université de Chicago, Chicago, Illinois, États-Unis

Jack A.Gilbert

Laboratoire de biologie marine, Woods Hole, MA, États-Unis

Jack A.Gilbert

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FDF a réalisé les expériences 16S et métatranscriptomique ainsi que l'analyse des données et a rédigé le manuscrit. DE a conçu l'étude et contribué à la préparation du manuscrit. Le JAG a contribué à l'analyse des données et à la préparation du manuscrit. AG et PF ont effectué l'analyse du métabolome.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

De Filippis, F., Genovese, A., Ferranti, P. et al. La métatranscriptomique révèle des changements fonctionnels liés à la température dans le microbiome ayant un impact sur le taux de maturation du fromage. Sci Rep 6, 21871 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21871

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Reçu : 22 octobre 2015

Accepté : 02 février 2016

Publié: 25 février 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep21871

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