Les données de performance du test démontrent l'utilité d'un réactif de test cutané DIVA pour bovins (DST

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12052 (2022) Citer cet article

1524 accès

3 Citations

2 Altmétrique

Détails des métriques

Bacillus Calmette-Guérin (BCG), une souche atténuée de Mycobacterium bovis (M. bovis), est le principal vaccin candidat pour le contrôle de la tuberculose bovine (TB) chez les bovins. Cependant, la vaccination par le BCG sensibilise les bovins à la tuberculine bovine, compromettant ainsi l'utilisation des tests actuels de surveillance de la tuberculose bovine. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un test cutané de diagnostic qui n'est pas compromis par la vaccination par le BCG et qui est capable de détecter les animaux vaccinés par le BCG qui développent par la suite une tuberculose bovine suite à une exposition à M. bovis. En s'appuyant sur des travaux antérieurs utilisant des réactifs de cocktail de protéines formulés "en interne", nous présentons ici les données de performance des tests pour une seule protéine de fusion (DST-F) contenant les antigènes mycobactériens ESAT-6, CFP-10 et Rv3615c formulés en tant que réactifs "prêts à l'emploi". ' réactif par un fabricant commercial. Nos résultats démontrent que, contrairement aux réactifs à la tuberculine, un test cutané de diagnostic utilisant le DST-F a maintenu une spécificité élevée chez les animaux vaccinés par le BCG. En outre, le test cutané DST-F a démontré une sensibilité relative élevée dans l'identification des animaux infectés par M. bovis, y compris ceux pour lesquels la vaccination par le BCG n'a pas réussi à prévenir la pathologie tuberculeuse bovine suite à une exposition expérimentale à M. bovis. Le DST-F fait actuellement l'objet d'essais sur le terrain en Grande-Bretagne pour soutenir son homologation et sa commercialisation.

La tuberculose bovine (TB) est une maladie qui touche d'importantes espèces d'élevage dans le monde. Bien que la maladie soit causée par des agents pathogènes du groupe de mycobactéries Mycobacterium tuberculosis, dans de nombreux pays (y compris le Royaume-Uni), la tuberculose bovine est causée presque exclusivement par M. bovis. La tuberculose bovine est une source importante de pertes économiques en raison à la fois d'une productivité réduite et du coût des programmes de contrôle, avec une perte économique mondiale estimée à environ 3 milliards de dollars US par an1. En outre, la tuberculose bovine a d'importantes conséquences zoonotiques, en particulier dans les pays à revenu faible ou intermédiaire où la pasteurisation du lait d'élevage ne peut être garantie2.

Au Royaume-Uni, comme dans de nombreux pays à revenu élevé, une stratégie de test et d'abattage est utilisée, basée sur le test SICCT (Single Intradermal Comparative Cervical Tuberculin), avec un test de libération d'interféron-gamma parfois appliqué comme test auxiliaire pour maximiser le détection des animaux infectés. Cependant, cette stratégie de contrôle a un coût élevé, à la fois financièrement où l'on estime que la lutte contre la tuberculose bovine en Angleterre coûte à elle seule environ 70 millions de livres sterling par an au contribuable avec des coûts supplémentaires de 50 millions de livres sterling pour les agriculteurs3, mais aussi éthiquement où environ 38 000 bovins ont été abattus en Grande-Bretagne entre juillet 2020 et juin 2021 pour lutter contre la maladie. Par conséquent, le développement d'un vaccin bovin contre la tuberculose bovine est une priorité de recherche élevée.

À ce jour, le seul vaccin disponible contre la tuberculose bovine est le bacille de Calmette-Guérin (BCG), une souche atténuée de M. bovis, et des études d'efficacité évaluant l'effet de la vaccination par le BCG contre l'infection expérimentale à M. bovis chez les bovins ont donné des résultats prometteurs4,5 . De plus, l'efficacité de la vaccination par le BCG a également été démontrée dans des études de terrain6,7,8,9. Cependant, bien que des études démontrent que la vaccination par le BCG réduit la gravité de la tuberculose bovine, elles soulignent également qu'elle n'est pas entièrement protectrice chez tous les vaccinés10,11,12,13,14,15. Ainsi, des tests de diagnostic sont toujours nécessaires pour détecter les animaux vaccinés par le BCG qui développent une tuberculose bovine suite à une exposition à M. bovis. Malheureusement, la vaccination par le BCG sensibilise les bovins aux réactifs actuels des tests cutanés de diagnostic (c'est-à-dire les dérivés protéiques purifiés de la tuberculine), ce qui empêche leur utilisation dans ce contexte16. Par conséquent, pour assurer la poursuite d'une stratégie de contrôle basée sur les tests et l'abattage dans le cadre de la vaccination par le BCG, les efforts de recherche se sont concentrés sur le développement d'un test cutané de diagnostic qui : (i) n'induit pas de réactions faussement positives au test cutané chez les animaux vaccinés par le BCG ; et (ii) est capable de détecter les animaux vaccinés par le BCG qui développent par la suite une tuberculose bovine suite à une exposition à M. bovis. Le développement initial de ce « test cutané DIVA » (DIVA : détection des infections parmi les animaux vaccinés) était basé sur l'évaluation de cocktails de protéines mycobactériennes recombinantes17 et a abouti à donner la priorité aux protéines ESAT-6, CFP-10 et Rv3615c18, tandis que d'autres améliorations ont exploré la utilisation de ceux-ci comme un seul réactif de protéine de fusion formulé « en interne »19. Pour étendre ces études, nous avons travaillé en étroite collaboration avec un fabricant commercial pour produire un réactif de protéine de fusion de test cutané DIVA (DST-F) « prêt à l'emploi », et les données de performance de ce réactif sont présentées ici.

Afin d'évaluer la capacité du DST-F à identifier les bovins infectés, une série d'études expérimentales sur l'infection à M. bovis (tableau 1 ; études 1 à 3) ont été menées. L'examen post mortem pour la pathologie de la tuberculose bovine et la culture d'échantillons de tissus post mortem ont confirmé l'infection à M. bovis chez les 71 animaux étudiés (données non présentées). Au total, 68 de ces animaux ont été testés positifs au DST-F (tableau 2), ce qui était supérieur à celui observé pour le test SICCT (62 tests positifs) et légèrement inférieur à celui observé pour le test SIT (70 tests positifs) . Bien que cela ait fourni des données de performance encourageantes pour le DST-F chez les animaux infectés par M. bovis, le véritable groupe cible d'animaux pour ce test sont les bovins vaccinés par le BCG qui ne sont pas totalement protégés contre le développement de la tuberculose bovine. Ainsi, afin d'évaluer la capacité du DST-F à identifier les bovins vaccinés par le BCG qui présentaient des signes de tuberculose bovine après une exposition expérimentale à M. bovis, nous avons effectué trois expériences vaccin/provocation distinctes (études 4 à 6). Encore une fois, à la fin de chaque expérience, tous les animaux ont été soumis à un examen post mortem détaillé où les signes de pathologie tuberculeuse bovine ont été notés et des échantillons de ganglions lymphatiques et de tissus pulmonaires ont été prélevés pour la culture de M. bovis. Les résultats de ces investigations sont résumés à la Fig. 1. Dans les trois expériences, le niveau de pathologie visible dans le tissu des ganglions lymphatiques était significativement plus faible dans le groupe d'animaux vaccinés/infectés par rapport au groupe témoin infecté uniquement dans cette expérience. De même, dans deux des trois expériences, le score total de lésion visible était également significativement plus faible dans ce groupe d'animaux. Ainsi, les trois expériences ont démontré un effet protecteur de la vaccination par le BCG sur la sévérité de la pathologie TB bovine suite à une infection expérimentale par M. bovis. Cependant, ces résultats ont également indiqué que bien que le BCG limite la gravité de la pathologie de la tuberculose bovine, il n'a pas empêché l'infection à M. bovis en soi, car M. bovis pouvait être cultivé à partir de tissus post mortem de tous les 73 vaccinés par le BCG/M . bovis infectés (données non présentées). Ainsi, nous avons évalué la capacité du réactif DST-F à détecter les 72 cultures confirmées vaccinées par le BCG/M. bovis des animaux infectés. Sur ces 72 animaux, 65 ont été testés positifs au réactif DST-F (tableau 2), ce qui était supérieur à celui observé pour le test SICCT (61 tests positifs) mais inférieur à celui observé pour le test SIT (72 tests positifs). Pour les non-vaccinés/M. bovis, les animaux témoins infectés de ces études ont tous montré des signes d'infection à M. bovis et, à l'exception d'un animal dans l'étude 6, ont été testés positifs au réactif DST-F. Tous les animaux de ces groupes ont également été testés positifs aux tests SICCT et SIT.

Réduction de la pathologie visible de la tuberculose bovine chez les vaccinés BCG. Scores ganglionnaires, pulmonaires et pathologiques totaux pour les vaccinés BCG/M. bovis infectés (Vac/Inf) et les non-vaccinés/M. bovis infectés témoins (Inf) de l'étude 4 (A), de l'étude 5 (B) et de l'étude 6 (C). Chaque symbole représente un animal individuel tandis que les barres horizontales représentent les valeurs médianes du groupe. *p < 0,05, **p < 0,01, test de Mann Whitney.

Afin d'évaluer le niveau de résultats faussement positifs induits par le DST-F, des tests cutanés ont été réalisés sur trois groupes d'animaux non infectés (études 7 à 9) et les résultats sont résumés dans le tableau 2. Dans les deux études avec animaux témoins non infectés, aucune réponse faussement positive au DST-F ou aux réactifs à la tuberculine n'a été observée. De même, aucune réponse faussement positive au DST-F n'a été observée chez les 20 veaux vaccinés au BCG (étude 9). En revanche, une forte proportion des veaux vaccinés au BCG qui ont été testés avec des réactifs à la tuberculine ont donné des réponses faussement positives, avec respectivement 7/10 et 10/10 tests positifs aux tests SICCT et SIT.

Les données des tests cutanés générées à partir de ces neuf études ont été combinées et sont résumées dans le tableau 3. La sensibilité relative du DST-F à la détection des animaux infectés par M. bovis était de 95 %, ce qui était supérieur à celui du test SICCT (89 %). mais inférieur à celui du test SIT (99%). Cependant, aucune de ces différences n'a atteint une signification statistique. La sensibilité relative du DST-F dans la détection des animaux vaccinés par le BCG qui présentaient des signes de tuberculose bovine suite à une infection expérimentale à M. bovis était légèrement inférieure à 90 %. Encore une fois, cela était supérieur à celui du test SICCT (85%), mais significativement (p < 0,05, test de McNemar) inférieur à celui du test SIT (100%). Aucun des trois tests cutanés n'a induit de réponses faussement positives chez les animaux témoins non infectés, ce qui a donné des estimations de spécificité de 100 %. De même, aucune réponse faussement positive au DST-F n'a été observée chez les animaux vaccinés par le BCG, ce qui se traduit à nouveau par une estimation de spécificité de 100 %. En revanche, des valeurs significativement plus faibles pour les tests SICCT (p < 0,05, test de McNemar) et SIT (p < 0,01, test de McNemar) ont été observées dans ce groupe d'animaux, avec des estimations de spécificité de 30 % et 0 % respectivement.

Notre développement initial d'un réactif de test cutané DIVA était basé sur des cocktails de protéines mycobactériennes recombinantes qui étaient immunogènes chez les bovins infectés par M. bovis mais n'induisaient pas de réponses chez les animaux naïfs ou vaccinés par le BCG17, et un cocktail comprenant ESAT-6, CFP-10 et les protéines Rv3615c ont été classées par ordre de priorité pour évaluation dans différents groupes de bovins. Les résultats de ces analyses ont démontré une haute spécificité de ce réactif lorsqu'il est testé sur des animaux vaccinés par le BCG ou des témoins non infectés, tout en conservant une relative sensibilité pour la détection de l'infection similaire à celle du test tuberculinique SICCT lorsqu'il est évalué en interprétation standard18. Cependant, du point de vue de la fabrication, la production d'un seul réactif de protéine de fusion présente de nombreux avantages par rapport à un composé d'un cocktail de trois protéines individuelles. Par exemple, un seul cycle de production est nécessaire pour la protéine de fusion, par opposition à trois cycles de production distincts requis pour les composants du cocktail. De plus, par rapport à la production du réactif cocktail, la production d'une seule protéine de fusion réduirait d'un tiers les données de contrôle qualité associées requises. Enfin, il ne serait pas nécessaire d'avoir un système en place pour formuler un réactif cocktail à partir des trois composants produits individuellement. Les données de preuve de concept ont démontré qu'une protéine de fusion d'ESAT-6, CFP-10 et Rv3615c induisait la production in vitro d'IFN-γ en utilisant des cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de bovins infectés par M. bovis, mais pas de témoins naïfs ou d'animaux vaccinés au BCG19. De plus, cette protéine de fusion a généré des réactions cutanées positives chez les animaux infectés par M. bovis mais pas chez les témoins naïfs lorsqu'elle a été formulée « en interne » comme réactif de test cutané19. Afin de développer davantage ce réactif en un produit commercial potentiel, nous avons travaillé avec le fabricant (c'est-à-dire Lionex) pour produire un réactif de test cutané DIVA à protéine de fusion (appelé DST-F) qui pourrait être utilisé « directement à partir du flacon » dans de la même manière que les réactifs à la tuberculine. En outre, des protocoles de contrôle de la qualité et des critères de libération des lots (voir matériel et méthodes) ont été développés pour garantir la cohérence d'un lot à l'autre, en gardant à l'esprit le potentiel de mise à l'échelle jusqu'à la fabrication commerciale conformément aux normes de bonnes pratiques de fabrication. Au total, les réactifs de test cutané DIVA basés sur les formulations de protéines de cocktail et de fusion ont été testés « face à face » sur 191 animaux individuels (données non publiées). L'analyse statistique évaluant le résultat du test des deux réactifs a démontré une concordance observée de 94 % avec un coefficient kappa de Cohen de 0,885 (IC à 95 % de 0,819 à 0,951), indiquant une "concordance presque parfaite"20 entre les deux réactifs (données non présentées ). Ainsi, compte tenu des avantages de fabrication de la protéine de fusion, le réactif DST-F a été sélectionné comme réactif de test cutané DIVA candidat à faire avancer.

Comme résumé dans le tableau 3, la sensibilité relative du DST-F dans l'identification des animaux confirmés expérimentalement infectés par M. bovis était de 95 % (IC à 95 % de 88 % à 98 %), ce qui était supérieur à celui du test SICCT effectué au même temps chez ces animaux. Cependant, il convient de noter que cette estimation de la sensibilité relative a été générée à l'aide d'animaux infectés expérimentalement et peut ne pas représenter pleinement les performances du test DST-F lorsqu'il est utilisé chez des bovins naturellement infectés. En effet, les données publiées précédemment pour la formulation du cocktail de test cutané DIVA ont démontré une proportion significativement plus faible de tests positifs chez les animaux naturellement infectés par rapport aux animaux infectés expérimentalement (respectivement 78 et 100 % ; p < 0,05, test exact de Fisher), bien qu'il faille le souligner que la proportion d'animaux naturellement infectés testés positifs au test SICCT standard était également d'environ 76%18. De plus, nos données initiales de preuve de concept pour la formulation de protéines de fusion « maison » ont démontré un résultat similaire, avec 76 % d'animaux infectés naturellement (16 sur 21) par rapport à 100 % d'animaux infectés expérimentalement (6 sur 6) donnant un résultat positif au test cutané (données non présentées). Ainsi, l'un des objectifs de nos recherches actuelles est d'évaluer davantage les performances du DST-F sur un nombre accru de bovins naturellement infectés afin de fournir des calculs de précision statistiquement robustes de la sensibilité du test DST-F dans un scénario réaliste pour soutenir le futur test DST-F. exercices de validation.

De nombreuses études de vaccination/provocation au cours des 25 dernières années démontrent que la vaccination par le BCG réduit la gravité de la tuberculose bovine4. Cependant, étant donné que les animaux vaccinés par le BCG peuvent encore développer une tuberculose bovine (quoique avec moins de gravité), il est crucial que nous comprenions la capacité des réactifs de diagnostic à détecter ces animaux. À cette fin, nous avons effectué trois expériences de vaccination BCG / infection à M. bovis pour évaluer la sensibilité relative du DST-F dans la détection des animaux qui présentaient des signes de tuberculose bovine après exposition à M. bovis. Les résultats de ces études ont mis en évidence une sensibilité relative élevée de 90% (IC 95% de 81% à 95%), qui ne différait pas significativement (p=0,348, test exact de Fisher) de la valeur estimée chez les non vaccinés/M. bovis infectés (tableau 3). Comparativement aux animaux non vaccinés, les bovins vaccinés par le BCG ont montré une réduction du nombre de lésions tuberculeuses, de la gravité des lésions tuberculeuses et du nombre de bactéries viables récupérées dans les tissus affectés11,15,21,22,23. Ainsi, on pourrait s'attendre à ce que cette réduction du fardeau de la maladie entraîne une activation continue plus faible des réponses immunitaires effectrices aux antigènes mycobactériens, ce qui à son tour peut compromettre la sensibilité des tests de diagnostic qui utilisent ces réponses comme lecture. Dans cet esprit, il est encourageant que la sensibilité relative du DST-F soit restée élevée dans le groupe d'animaux cibles, c'est-à-dire les animaux vaccinés par le BCG qui ont démontré des signes de tuberculose bovine suite à une exposition à M. bovis.

Pour générer des données de spécificité, le réactif DST-F a été testé dans deux groupes d'animaux : (i) des veaux non infectés et (ii) des veaux vaccinés par le BCG. Comme le montre le tableau 3, les résultats de ces études étaient conformes aux données publiées antérieurement pour le cocktail de tests cutanés DIVA18 et ont confirmé que le réactif DST-F maintenait le haut niveau de spécificité requis pour un test DIVA compatible avec la vaccination par le BCG dans des conditions expérimentales. Pour fournir une assurance supplémentaire à cet égard, une évaluation plus approfondie de la spécificité du DST-F est actuellement prévue dans des essais sur le terrain (voir ci-dessous).

Les données de performance du DST-F présentées ici faisaient partie d'une demande auprès de la Direction des médicaments vétérinaires du Royaume-Uni pour un certificat d'expérimentation animale (ATC) afin de permettre le début des essais sur le terrain pour le DST-F. Cette demande contenait également un résumé du processus de fabrication (fourni par Lionex) et les résultats d'une étude de sécurité menée par l'Agence de la santé animale et végétale (APHA) selon les normes de bonnes pratiques de laboratoire, où une dose unique et répétée de DST-F ont été évaluée chez les veaux naïfs et vaccinés par le BCG en surveillant le site d'injection et les paramètres de santé généraux (y compris la température, les observations cliniques et le comportement général). La conclusion de cette étude était que l'administration intradermique de DST-F seul ou en même temps que l'administration de réactifs de test cutané à la tuberculine n'a provoqué aucun effet indésirable local ou systémique chez les veaux naïfs ou vaccinés par le BCG (données non présentées). L'ATC a été attribué avec succès et des essais sur le terrain sont actuellement en cours au Royaume-Uni pour confirmer initialement l'innocuité et la spécificité du réactif DST-F chez un plus grand nombre de bovins non vaccinés dans des situations de terrain, avant de poursuivre l'évaluation sur le terrain dans un grand nombre de BCG bovins vaccinés, dans l'intention que les données générées par ces études appuient une future autorisation de mise sur le marché pour le réactif DST-F.

Au total, 3 études ont été réalisées (tableau 1 ; études 1 à 3). Dans tous les cas, les veaux mâles (âgés de 6 à 12 mois) provenaient de troupeaux officiellement indemnes de tuberculose bovine en Grande-Bretagne qui n'avaient aucun antécédent récent de tuberculose bovine et ont été hébergés à l'APHA Weybridge tout au long de l'expérience. Des tests cutanés ont été effectués environ 5 à 6 semaines après l'infection. Les détails des animaux sont résumés dans le tableau 1.

Au total, 3 études ont été réalisées (tableau 1 ; études 4 à 6). Pour les deux expériences menées à l'APHA Weybridge (études 4 et 5), les veaux mâles (âgés de 4 à 8 mois) provenaient de troupeaux officiellement indemnes de tuberculose bovine en Grande-Bretagne qui n'avaient aucun antécédent récent de tuberculose bovine et étaient hébergés à l'APHA Weybridge tout au long de l'expérience. Pour l'expérience menée par AgResearch (étude 6), des bovins femelles (âgées d'environ 12 mois) ont été obtenues à partir de troupeaux accrédités exempts de tuberculose d'une région de Nouvelle-Zélande où les animaux d'élevage et sauvages étaient exempts de tuberculose. Les animaux ont été gardés et vaccinés à la ferme AgResearch Aorangi, tandis qu'immédiatement avant l'épreuve avec M. bovis, les bovins ont été transportés vers l'unité de confinement de la tuberculose dans la ferme AgResearch Kaitoke. Des tests cutanés ont été effectués entre 8 et 14 semaines après l'infection. Les détails des animaux sont résumés dans le tableau 1.

Au total, 2 études ont été réalisées (Tableau 1 ; études 7 et 8). Pour l'étude 7, les veaux mâles (âgés de 8 à 12 mois) provenaient de troupeaux officiellement indemnes de tuberculose bovine en Grande-Bretagne qui n'avaient aucun antécédent récent de tuberculose bovine et ont été hébergés à l'APHA Weybridge tout au long de l'expérience. Pour l'étude 8, des veaux (âgés de 40 à 54 jours) ont été inscrits à une étude de sécurité DST-F menée selon les normes de qualité des bonnes pratiques de laboratoire (BPL) pour générer des données à l'appui d'une demande de certificat d'expérimentation animale auprès de la Direction des médicaments vétérinaires (Weybridge, Royaume-Uni). ). Comme l'organisme de réglementation avait pour exigence essentielle de démontrer que ces veaux étaient exempts de tuberculose bovine, ils provenaient d'un lieu connu exempt de tuberculose, au Danemark. Les détails des animaux sont résumés dans le tableau 1.

Comme décrit ci-dessus, des veaux (âgés de 43 à 57 jours) ont également été inscrits à une étude d'innocuité DST-F chez des veaux vaccinés au BCG. Des tests cutanés ont été effectués 7 semaines après la vaccination par le BCG. Les détails des animaux sont résumés dans le tableau 1 (étude 9).

Toutes les expériences impliquant des animaux vivants ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes, et conformément aux directives ARRIVE. Les procédures animales et les protocoles expérimentaux ont été approuvés par un comité institutionnel nommé : pour les travaux menés à l'APHA, il s'agissait de l'APHA Animal Welfare and Ethical Review Board (références 70/7737–2-007, PF7D840A5-2-004v, 70/7737–1- 012 et PFFFE51F-2–002), tandis que pour les travaux menés à AgResearch, il s'agissait du Grasslands Animal Ethics Committee (référence AE 14 741).

La souche danoise BCG 1331 (AJVaccines, Copenhague, Danemark) a été utilisée pour toutes les vaccinations. Tous les inoculums de BCG ont été préparés le jour de la vaccination en reconstituant chaque flacon de BCG avec 1 ml de diluant Sauton et 0,5 ml a été administré par voie sous-cutanée aux animaux. L'inoculum utilisé a été titré en étalant des dilutions en série pour calculer la dose réelle délivrée (tableau 1). Dans les expériences de vaccin/provocation, les animaux témoins non vaccinés n'ont reçu aucun vaccin BCG (étude 6) ou une injection sous-cutanée de 0,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (études 4 et 5).

Les animaux des études 1 à 6 ont été expérimentalement infectés par voie endotrachéale/endobronchique avec une souche virulente de M. bovis (AF2122/97 pour les études 1 à 5 ; 83/6235 pour l'étude 6). En bref, pour les études 1 à 5, les veaux ont été sédatés avec 2 % de Rompun (0,12 ml/50 kg, voie iv ; inversion avec la même dose d'Antisedan, voie iv) avant l'insertion d'un endoscope à travers la cavité nasale dans la trachée pour livraison de l'inoculum (2 ml) à travers une canule de 1,8 mm de diamètre interne juste en dessous de la bifurcation principale entre les lobes gauche et droit. Deux ml de PBS ont été utilisés pour rincer tout reste d'inoculum de la canule, puis la canule et l'endoscope ont été retirés et la canule jetée. Le canal à travers lequel la canule a été insérée dans l'endoscope a été rincé avec 20 ml d'eau stérile et l'extérieur de l'endoscope a été essuyé avec des lingettes stérilisantes avant l'infection de l'animal suivant. Pour l'étude 6, les veaux ont été infectés comme décrit précédemment21. Le M. bovis dans l'inoculum utilisé pour infecter le bétail a été cultivé pour déterminer les UFC. Pour les expériences de vaccin/provocation (études 4 à 6), les animaux ont été infectés environ 8 à 10 semaines après la vaccination. Les détails de la dose de provocation et du temps de provocation sont résumés dans le tableau 1.

Des examens post mortem (EMP) ont été effectués sur les animaux infectés à la fin de l'expérience pour quantifier le niveau de pathologie tuberculeuse observé dans les poumons et les ganglions lymphatiques en utilisant une modification d'un système de notation précédemment publié24. Dans la majorité des études, les ganglions lymphatiques suivants ont été examinés : sous-maxillaires gauche et droit ; rétropharyngé médial gauche et droit ; crânien médiastinal ; caudale médiastinale ; bronchique gauche et droite; et trachéobronchique crânienne. Les exceptions étaient les études 4 et 5, où, pour des raisons logistiques et pratiques, les ganglions lymphatiques de la tête (rétropharyngés sous-maxillaires et médiaux) n'ont pas été examinés. Chaque ganglion lymphatique a été tranché en série en sections de 1 mm d'épaisseur et un score de pathologie appliqué en fonction du nombre et de l'étendue des lésions observées en utilisant les critères suivants : score 0 pour aucune lésion visible ; score 1 pour une seule petite lésion (1 à 2 mm de diamètre), score 2 pour deux à cinq petites lésions ou une seule grande surface (au moins 5 mm sur 5 mm) ; score 3 pour cinq à vingt petites lésions ou deux à trois grandes surfaces ; score 4 pour plus de vingt petites lésions ou plus de trois grandes surfaces ; et score 5 pour une pathologie consolidée de plus de 50 % du ganglion lymphatique. De plus, chaque lobe des poumons a été tranché en série en sections de 5 à 10 mm et noté de la manière suivante : score 0 pour aucune lésion visible ; score 1 pour une seule petite lésion (< 10 mm de diamètre) ; score 2 pour deux à cinq petites lésions ; score 3 pour cinq à vingt petites lésions ou une seule grande surface (> 10 mm de diamètre) ; score 4 pour plus de vingt petites lésions ou plus d'une grande surface ; score 5 pour une zone affectée importante du poumon contenant des lésions. Des échantillons de ganglions lymphatiques et de tissus pulmonaires ont également été prélevés à l'autopsie pour la culture de M. bovis.

Les tissus collectés au PME ont été stockés congelés à - 80 ° C avant le traitement. En bref, des échantillons individuels ont été décongelés, homogénéisés dans 10 ml de PBS à l'aide d'un mélangeur à palettes Seward Stomacher et étalés sur des plaques de gélose 7H11 modifiées16. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant un minimum de 4 semaines avant le dénombrement des colonies individuelles sur les plaques.

Des dérivés de protéines purifiées de M. avium (PPD-A ; 25 000 UI/ml) et M. bovis (PPD-B ; 30 000 UI/ml) ont été obtenus auprès d'un fabricant commercial (Thermo Fisher, Royaume-Uni). Le réactif DST-F, constitué d'une protéine recombinante de fusion marquée à l'histidine d'ESAT-6, CFP-10 et Rv3615c dans du PBS, a été produit par un fabricant commercial (Lionex, Braunschweig, Allemagne). En bref, la protéine de fusion DST-F a été exprimée dans Escherichia coli (E. coli), purifiée par chromatographie d'affinité au nickel, repliée contre 10 mM NH4HCO3 (pH 8,0), tampon échangée contre PBS (pH 7,4) et enfin diluée dans PBS pour une concentration de 300 µg/ml avant la mise en bouteille dans des flacons en verre EP de type 1 avec des bouchons de fermeture et scellés avec des capsules en aluminium. Les critères de libération des lots comprenaient : teneur en protéines de 300 µg/ml ± 5 % ; Démonstration par Western blot d'une réaction positive lors de l'utilisation d'anticorps anti-histidine et d'anticorps spécifiques aux protéines, mais aucune réaction avec un anti-E. coli anticorps; une pureté supérieure à 95 % par analyse SDS-PAGE et densitométrie ; teneur en endotoxines inférieure à 25 UI/mg ; et stérilité conformes à la monographie 2.6 de la Pharmacopée Européenne.

Les tests cutanés ont été effectués conformément aux instructions pour les tests de tuberculose chez les bovins, disponibles via la passerelle APHA Vet. En bref, les sites d'injection situés à la frontière du tiers antérieur et moyen du cou de chaque côté de l'animal ont été coupés et l'épaisseur de la peau avant l'injection a été enregistrée. Les tests cutanés à la tuberculine et au DST-F ont été réalisés par injection intradermique de 0,1 ml de réactif PPD-A et PPD-B, ou DST-F respectivement. Après 72 h, les sites de test cutané ont été vérifiés pour les réactions par palpation de la peau. Si des réactions palpables étaient détectées, l'épaisseur de la peau au site d'injection était re-mesurée et enregistrée. Si aucune réaction palpable n'a été détectée, les valeurs de pré-injection ont été utilisées. L'exception à cela était les études de sécurité BPL (études 8 et 9), où l'épaisseur de la peau à 72 h était mesurée automatiquement. Les résultats sont exprimés en augmentation de l'épaisseur de la peau à 72 h par rapport à l'épaisseur avant l'injection. Les horaires du test cutané pour chaque expérience sont détaillés dans le tableau 1.

Les analyses ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, USA). Le degré de pathologie entre les veaux vaccinés au BCG et les veaux témoins a été comparé à l'aide du test de Mann-Whitney. Le test de paires appariées de McNemar ou le test exact de Fisher ont été utilisés, le cas échéant, pour comparer les proportions de tests positifs et négatifs. Une valeur de p inférieure à 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Waters, WR, Palmer, MV, Buddle, BM & Vordermeier, HM Recherche sur le vaccin contre la tuberculose bovine : perspectives historiques et avancées récentes. Vaccin 30, 2611-2622. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.02.018 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ashford, DA, Whitney, E., Raghunathan, P. & Cosivi, O. Épidémiologie de mycobactéries sélectionnées qui infectent les humains et d'autres animaux. Rev. Sci. Technologie. 20, 325–337. https://doi.org/10.20506/rst.20.1.1266 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Godfray, C., Donnelly, C., Hewinson, G., Winter, M. & Wood, J. (ed DEFRA) (Londres, Royaume-Uni, 2018).

Buddle, BM, Vordermeier, HM, Chambers, MA & de Klerk-Lorist, LM Efficacité et innocuité du vaccin BCG pour le contrôle de la tuberculose chez le bétail domestique et la faune. Devant. Vétérinaire. Sci. 5, 259. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00259 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Srinivasan, S. et al. Une méta-analyse de l'effet de la vaccination par le bacille calmette-guerin contre la tuberculose bovine : le parfait est-il l'ennemi du bien ?. Devant. Vétérinaire. Sci. 8, 637580. https://doi.org/10.3389/fvets.2021.637580 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopez-Valence, G. et al. Évaluation sur le terrain de l'efficacité protectrice du vaccin Mycobacterium bovis BCG contre la tuberculose bovine. Rés. Vétérinaire. Sci. 88, 44–49. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2009.05.022 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nugent, G., Yockney, IJ, Cross, ML & Buddle, BM La vaccination par le BCG à faible dose protège les bovins en liberté contre la tuberculose bovine d'origine naturelle. Vaccin 36, 7338–7344. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.10.025 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nugent, G., Yockney, IJ, Whitford, J., Aldwell, FE & Buddle, BM Efficacité de la vaccination orale par le BCG pour protéger les bovins en liberté contre l'infection naturelle par Mycobacterium bovis. Vétérinaire. Microbiol. 208, 181–189. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2017.07.029 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Retamal, P. et al. La vaccination des génisses Holstein avec la souche Mycobacterium bovis BCG induit une protection contre la tuberculose bovine et des rendements de production de lait plus élevés dans un contexte de transmission naturelle. Transfrontalier. Urgence Dis. https://doi.org/10.1111/tbed.14108 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Buddle, BM et al. Vaccination des bovins avec Mycobacterium bovis BCG par une combinaison des voies systémique et orale. Tuberculose (Edinb) 88, 595–600. https://doi.org/10.1016/j.tube.2008.01.005 (2008).

Article Google Scholar

Hope, JC et al. Identification de substituts et de corrélats de protection dans l'immunité protectrice contre l'infection à Mycobacterium bovis induite chez les veaux nouveau-nés par la vaccination avec M. bovis BCG Pasteur et M. bovis BCG Danish. Clin. Vaccin Immunol. 18, 373–379. https://doi.org/10.1128/CVI.00543-10 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parlane, NA et al. La revaccination des bovins avec le bacille de Calmette-Guérin deux ans après la première vaccination lorsque l'immunité a diminué, a renforcé la protection contre l'épreuve par Mycobacterium bovis. PLoS ONE 9, e106519. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106519 (2014).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thom, ML et al. Durée de l'immunité contre Mycobacterium bovis suite à une vaccination néonatale avec le bacille de Calmette-Guérin Danois : Protection significative contre l'infection à 12 mois, mais pas à 24 mois. Clin. Vaccin Immunol. 19, 1254-1260. https://doi.org/10.1128/CVI.00301-12 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wedlock, DN, Aldwell, FE, Vordermeier, HM, Hewinson, RG & Buddle, BM La protection contre la tuberculose bovine induite par la vaccination orale des bovins avec Mycobacterium bovis BCG n'est pas améliorée par la co-administration de vaccins protéiques mycobactériens. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 144, 220–227. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2011.09.005 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wedlock, DN, Denis, M., Vordermeier, HM, Hewinson, RG & Buddle, BM La vaccination du bétail avec les souches danoise et pasteur de Mycobacterium bovis BCG induit différents niveaux d'IFNgamma après la vaccination, mais induit des niveaux similaires de protection contre la tuberculose bovine . Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 118, 50–58. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2007.04.005 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Whelan, AO et al. Absence de corrélation entre la sensibilisation au test cutané à la tuberculine induite par le BCG et l'immunité protectrice chez les bovins. Vaccin 29, 5453–5458. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.05.057 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Whelan, AO et al. Développement d'un test cutané pour la tuberculose bovine permettant de différencier les animaux infectés des animaux vaccinés. J.Clin. Microbiol. 48, 3176–3181. https://doi.org/10.1128/JCM.00420-10 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Vordermeier, HM, Jones, GJ, Buddle, BM, Hewinson, RG & Villarreal-Ramos, B. Tuberculose bovine chez les bovins : vaccins, tests DIVA et découverte de biomarqueurs hôtes. Ann. Rév. Anim. Biosci. 4, 87–109. https://doi.org/10.1146/annurev-animal-021815-111311 (2016).

Article CAS Google Scholar

Srinivasan, S. et al. Test cutané à antigène défini pour le diagnostic de la tuberculose bovine. Sci. Adv. 5, eaax4899. https://doi.org/10.1126/sciadv.aax4899 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Landis, JR & Koch, GG La mesure de l'accord des observateurs pour les données catégorielles. Biometrics 33, 159-174 (1977).

Article CAS Google Scholar

Buddle, BM, de Lisle, GW, Pfeffer, A. & Aldwell, FE Réponses immunologiques et protection contre Mycobacterium bovis chez les veaux vaccinés avec une faible dose de BCG. Vaccin 13, 1123-1130 (1995).

Article CAS Google Scholar

Buddle, BM et al. La revaccination des veaux nouveau-nés avec Mycobacterium bovis BCG réduit le niveau de protection contre la tuberculose bovine induit par une seule vaccination. Infecter. Immun. 71, 6411–6419 (2003).

Article CAS Google Scholar

Hope, JC et al. La vaccination des veaux nouveau-nés avec Mycobacterium bovis BCG induit une protection contre la provocation intranasale avec M. bovis virulent. Clin. Exp. Immunol. 139, 48–56. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2005.02668.x (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lyashchenko, K. et al. Association des réponses anticorps renforcées à la tuberculine avec la pathologie et l'immunité à médiation cellulaire chez les bovins vaccinés avec Mycobacterium bovis BCG et infectés par M. bovis. Infecter. Immun. 72, 2462-2467 (2004).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Ce travail a été financé par le budget de recherche sur la tuberculose bovine GB (subventions SE3304 et SE3312) détenu et administré de manière centralisée par Defra au nom de l'Angleterre, de l'Écosse et du Pays de Galles. Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l'APHA de l'unité des sciences animales pour leur dévouement au bien-être des animaux hébergés à l'APHA et de l'unité des services scientifiques pour la réalisation des études de sécurité DST-F, et le Dr Steve Houghton pour la consultation et les conseils sur le exigences réglementaires pour la demande de certificat d'expérimentation animale pour le réactif DST-F.

Immunologie et vaccinologie de la tuberculose, Département de bactériologie, Agence de la santé animale et végétale, New Haw, Addlestone, KT15 3NB, Surrey, Royaume-Uni

Gareth J. Jones, Timm Konold, Shellene Hurley, Tom Holder, Sabine Steinbach, Mick Coad et H. Martin Vordermeier

AgResearch, Palmerston North, Nouvelle-Zélande

D. Neil Mariage et Bryce M. Buddle

Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH, Brunswick, Allemagne

Mahaveer Singh

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

HMV et GJJ ont développé le concept DST-F. MS a développé la production du réactif DST-F. HMV, GJJ et DNW ont planifié les expériences et coordonné les études sur les animaux. TK, SH, TH, SS, MC et BMB ont réalisé les études animales et/ou les expériences de laboratoire. GJJ a analysé les données et préparé les tableaux et les figures. GJJ a écrit le texte qui a été édité par HMV, DNW et MS

Correspondance à Gareth J. Jones.

HMV, GJJ, TK, SH, TH, SS et MC sont employés par l'Agence de la santé animale et végétale (APHA) qui détient 3 brevets pour l'utilisation du Rv3615c dans les tests de diagnostic de la tuberculose bovine (WO/2009/060184, WO/2011 /135369 et WO/2012/010875). Le travail à l'APHA a été financé par le budget de recherche sur la tuberculose bovine du Royaume-Uni détenu et administré de manière centralisée par le Defra au nom de l'Angleterre, de l'Écosse et du Pays de Galles. MS est propriétaire de Lionex GmBH et détient des actions dans la société. Les autres auteurs (DNW et BMB) ne déclarent aucun conflit d'intérêt potentiel.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui autorise l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Jones, GJ, Konold, T., Hurley, S. et al. Les données de performance du test démontrent l'utilité d'un réactif de test cutané DIVA pour bovins (DST-F) compatible avec la vaccination par le BCG. Sci Rep 12, 12052 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

Télécharger la citation

Reçu : 09 mai 2022

Accepté : 01 juillet 2022

Publié: 14 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

Rapports scientifiques (2023)

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.

Nouvelles

Les données de performance du test démontrent l'utilité d'un réactif de test cutané DIVA pour bovins (DST