Application du gradient de densité pour l'isolement du composant fécal microbien des selles et son utilisation potentielle

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 16807 (2015) Citer cet article

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L'idée de considérer le microbiote intestinal comme un organe humain virtuel a conduit au concept de transplantation de microbiote fécal (FMT), qui a récemment connu un grand succès dans le traitement des cas d'infection récurrente à Clostridium difficile. L'administration d'un microbiote fécal sûr, viable et représentatif est cruciale pour la FMT. À notre connaissance, les techniques appropriées et les conditions systématiques pour séparer le microbiote fécal des échantillons de selles n'ont pas été étudiées de manière approfondie. Dans ce travail, nous montrons la possibilité de séparer les micro-organismes des selles du reste des matières fécales en utilisant une procédure avec un gradient de densité Nycodenz®, produisant 1010 bactéries viables pour deux grammes de matières fécales. Cette procédure n'a pas affecté la composition originale du microbiote en termes de viabilité, de distribution et de proportions, telle qu'évaluée par une approche métagénomique phylogénétique. L'obtention du microbiote fécal par concentration et séparation des microorganismes du reste des composants des selles permettrait la standardisation de sa récupération et sa conservation à long terme. La FMT ou des thérapies similaires de restauration du microbiote pourraient être utilisées pour le traitement de plusieurs troubles, voire à des fins esthétiques, de sorte que la méthode décrite dans nos travaux peut contribuer à jeter les bases du développement de produits sûrs et standardisés.

Le tractus gastro-intestinal (GI) humain est un écosystème complexe dans lequel le microbiote résident et les nutriments interagissent en permanence avec les cellules hôtes1. Le microbiote intestinal est composé de trillions de bactéries, dépassant d'un ordre de grandeur les cellules eucaryotes de notre corps2 et l'idée de considérer notre microbiote intestinal comme un organe virtuel gagne en popularité au sein de la communauté scientifique3. Les gènes fournis par notre microbiote intestinal sont dénommés « microbiome intestinal », mais parfois le terme « microbiome humain » (théoriquement le complément génétique de tous les microbes habitant notre corps) est utilisé comme synonyme4. Comptant près de 10 000 000 de gènes uniques, bien plus que le nombre « modeste » de 21 000 gènes humains5,6, notre microbiote intestinal complète les attributs métaboliques qui sont absents de notre organisme, notamment la capacité de tirer parti de nutriments autrement non métabolisables, la production d'acides gras à chaîne courte ou de vitamines et bien d'autres7. Au contraire, l'hôte humain fournit au microbiote des nutriments, c'est-à-dire que notre IG est une sorte de jardin microbien où chaque individu cultive ses propres microbes bénéfiques.

Au cours des dernières années, les grandes avancées des technologies de séquençage à haut débit et leur application à l'étude des communautés microbiennes intestinales ont fourni des preuves croissantes que le microbiote intestinal a un impact important sur la maturation réussie de notre système immunitaire et sur plusieurs facettes de la vie humaine. physiologie, qui peut inclure le déclenchement, la progression et l'installation de plusieurs maladies. Non seulement les profils du microbiote intestinal sont affectés par l'alimentation8,9, l'âge10 ou la géographie11, mais l'altération de la composition de nos micro-organismes intestinaux a été liée à certains troubles intestinaux et auto-immuns tels que l'obésité12, le syndrome métabolique13, la polyarthrite rhumatoïde14, le diabète de type 115, l'intestin inflammatoire maladies16 et le lupus érythémateux disséminé (LES)17.

Si l'on s'accorde à dire que le microbiote humain est un de nos organes de plus, le concept de transplantation de microbiote fécal (FMT) va vite surgir. Dans la littérature scientifique, la FMT a été décrite pour la première fois à la fin des années 195018 et peut être définie comme «l'apport de selles traitées d'un individu en bonne santé à l'intestin d'une personne malade par lavement, coloscopie ou autre moyen»19. Notamment, la FMT a eu une efficacité impressionnante (plus de 90 % de succès dans certains cas) dans le déplacement de l'infection récurrente à Clostridium difficile de l'intestin des personnes atteintes qui ne répondaient pas à l'antibiothérapie et dans le rétablissement d'un microbiote intestinal équilibré20. Très récemment, la FMT a été appliquée avec succès pour traiter la colite induite par les antibiotiques21. La généralisation de la FMT non réglementée dans certaines populations a conduit la Food and Drug Administration (FDA) américaine à réglementer strictement les fèces en tant que médicament biologique22.

Ces propriétés de la FMT sur la santé intestinale humaine ont eu un impact important sur la société, notamment des milliers d'entrées sur des réseaux sociaux et des blogs bien connus, ainsi que la création de fondations et d'autres organisations à but non lucratif dédiées à la promotion de l'application de la FMT ( par exemple http://thefecaltransplantfoundation.org/, http://thepowerofpoop.com/, http://www.openbiome.org/). La méthodologie actuelle pour la FMT comprend le traitement des matières fécales fraîches des donneurs le même jour. Cependant, certains protocoles ont été publiés afin de séparer le microbiote intestinal du reste des matières fécales par microfiltration, permettant par exemple son stockage23. Suite à ce protocole, le microbiote intestinal est d'abord microfiltré en présence d'un cryoprotecteur puis congelé à -80°C. Cette préparation microbienne s'est avérée aussi efficace qu'une préparation de matières fécales fraîches pour le déplacement de Clostridium difficile, comme en témoigne le profilage du gène de l'ARNr 16S24.

Les applications potentielles de la FMT, autres que les infections récurrentes à C. difficile, sont nombreuses mais méritent des études sur la normalisation et la standardisation de ce qu'est le microbiote fécal sain. Premièrement, l'extraction du microbiote et sa séparation du reste de la matière fécale dans des conditions contrôlées pourraient permettre d'éviter le caractère peu attrayant des matières fécales. Deuxièmement, cela pourrait permettre la préservation à long terme du microbiote fécal, permettant sa propagation dans des bioréacteurs, même de nombreuses années après son extraction. De plus, il facilitera les tâches telles que le dépistage dans les selles des virus (VIH, hépatite et autres), des parasites et autres micro-organismes indésirables.

Dans ce travail, nous décrivons l'application d'une procédure de séparation du microbiote fécal par l'utilisation d'un gradient de densité. À l'aide du profilage métagénomique de l'ADNr 16S, nous avons confirmé que la structure globale de la communauté microbienne restait inchangée après avoir été séparée des selles. Les applications potentielles de cette méthode pour la préservation à long terme du microbiote intestinal sont également discutées.

L'approbation éthique de cette étude a été obtenue dans le cadre du projet AGL2010-14952, du ministère espagnol de l'Économie et de la Compétitivité ("Vers une meilleure compréhension de la fonctionnalité du microbiote intestinal dans certains troubles immunitaires"). L'approbation finale a été obtenue du Comité de bioéthique du CSIC (Consejo Superior de Investigaciones Científicas) et du Comité régional d'éthique pour la recherche clinique (Servicio de Salud del Principado de Asturias) conformément à la Déclaration d'Helsinki. Toutes les déterminations ont été effectuées avec le consentement écrit pleinement informé de tous les participants impliqués dans l'étude.

Des échantillons de selles de cette étude ont été obtenus auprès de cinq patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LES) et de trois témoins sains, sélectionnés dans une étude précédente dans laquelle la dysbiose du microbiote intestinal associée au LES a été décrite17. Les données cliniques et nutritionnelles détaillées de ces participants peuvent être récupérées dans l'étude mentionnée ci-dessus. Patients lupiques n'ayant pas utilisé d'antibiotiques, de glucocorticoïdes, de médicaments immunosuppresseurs, d'anticorps monoclonaux ou d'autres immunothérapies au cours des 6 mois précédant le prélèvement de l'échantillon.

Une partie de chaque échantillon de selles a été soumise à un gradient de densité afin de séparer le microbiote du reste de la matière fécale, selon la méthode de Courtois et collaborateurs avec quelques modifications25. Deux grammes de matières fécales ont été homogénéisés dans 18 mL de NaCl stérile à 0,9 % (p/v), dans un mélangeur à pales de laboratoire (Stomacher Lab Blender 400, Seward Ltd. UK) pendant 1 min. Une solution de Nycodenz® 80 % (p/v) (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Danemark) a été préparée dans de l'eau ultra pure et stérilisée à 121 °C pendant 15 min. Un volume de 10,5 ml de l'échantillon fécal dilué et homogénéisé a été placé au-dessus de 3,5 ml de la solution Nycodenz® et centrifugé pendant 40 min à 4 ° C (10 000 × g, rotor TST41.14, Kontron, Milan, Italie). La phase supérieure, contenant les débris solubles, a été jetée après l'étape de centrifugation et les couches correspondant au microbiote extrait avec 10,5 mL de PBS (Fig. 1) ont été collectées. Les suspensions cellulaires ont été maintenues sur de la glace pendant 5 minutes, afin de permettre aux débris non solubles de précipiter, ont ensuite été lavées deux fois et stockées dans des aliquotes de 1 ml, à -80 ° C, jusqu'à ce que l'extraction de l'ADN soit effectuée. Dans tous les cas, l'ADN provenant directement d'échantillons de selles homogénéisés ou des fractions de microbiote séparées correspondantes a été extrait à l'aide du kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen Ltd., Strasse, Allemagne), comme décrit dans un travail précédent26.

Workflow de la configuration expérimentale utilisée dans ce travail.

(A) Des échantillons fécaux homogénéisés dilués ont été chargés au-dessus d'une solution de Nycodenz®, comme décrit dans la section Matériel et méthodes. (B) Après centrifugation, quatre couches ont été formées. L'examen du contenu de la couche au microscope à contraste de phase nous a permis de déterminer la présence d'une couche, correspondant au microbiote fécal, entre deux couches contenant des débris fécaux solubles (supérieure) et insolubles (inférieure) toutes au-dessus du Nycodenz. (C) Photographie lumineuse de la couche de microbiote, montrant une grande diversité de tailles et de formes microbiennes. Barre, 10 μm.

Afin d'évaluer le rendement de l'extraction du microbiote et d'établir la viabilité du microbiote récupéré, trois échantillons fécaux supplémentaires de trois donneurs sains ont été analysés par cytométrie en flux avant et après l'extraction en gradient de densité. Pour le dénombrement des bactéries, les échantillons ont été mesurés à l'aide d'un cytomètre en flux (Cytomics FC500, Beckman-Coulter Inc., Miami, Floride, États-Unis) avec le kit de comptage des bactéries (InvitrogenTM, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Les valeurs absolues de comptage dans les échantillons ont été déterminées en prenant un minimum de 2 000 et un maximum de 10 000 billes étalons fluorescentes et selon l'analyse des zones correspondant aux billes : bactéries vivantes (colorées au Syto9) et bactéries mortes (colorées à l'iodure de propidium, Sigma, St. Louis, MO). Le signal de déclenchement a été établi au détecteur de diffusion latérale (SSC) (comme recommandé par le kit de comptage de bactéries, Invitrogen) et les signaux de fluorescence ont été collectés au détecteur FL1 (510-550 nm) pour le détecteur Syto9 et FL4 (660-700 nm) pour le propidium iodure. Du PBS microfiltré a été utilisé comme témoin négatif. De plus, comme contrôle du microbiote mort, nous avons traité une aliquote des échantillons fécaux à 98 ° C pendant 10 min plus 15 min sous exposition à la lumière UV. La viabilité du microbiote dans chaque échantillon a été calculée en pourcentage de bactéries vivantes dans le microbiote fécal avant et après la procédure d'extraction Nycodenz®. Le nombre absolu de bactéries a été calculé en utilisant les billes fluorescentes comme étalon interne dans chaque échantillon, en suivant les recommandations du fournisseur pour le comptage ratiométrique. Les concentrations relatives ont été exprimées en nombre absolu de bactéries par rapport aux grammes de matières fécales sèches totales, qui ont été déterminées selon les normes FIL-IDF27,28.

Des amplicons partiels du gène de l'ARNr 16S ont été obtenus avec les amorces Probio_Uni et Probio_Rev (ciblant la région V3 et V4) par PCR comme décrit dans les travaux précédents de notre groupe de recherche17,26. Des bibliothèques de séquences utilisant le kit Ion Sequencing 200 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ont été préparées à partir des produits de PCR purifiés et séquencées dans un système Ion Torrent PGM dans les installations de GenProbio Ltd (http://www.genprobio. com). Après le séquençage, les groupes de lecture de séquences spécifiques tels que les séquences de faible qualité et polyclonales ont été supprimés par le logiciel PGM. Les séquences correspondant à l'adaptateur PGM 3 'ont également été automatiquement coupées. Toutes les données approuvées par PGM, ajustées et filtrées ont été exportées sous forme de fichiers .sff.

Les fichiers .sff ont été traités à l'aide de QIIME 1.7.0 avec les scripts et procédures décrits dans les travaux précédents26,29. Seules les lectures de séquence d'une longueur comprise entre 150 et 200 pb, ainsi qu'un score moyen de qualité de séquence supérieur à 25 ont été retenues dans le cadre du contrôle qualité. Les séquences ont été coupées à la première base si une fenêtre roulante de 10 pb de faible qualité a été trouvée et d'autres séquences telles que des homopolymères (> 7 pb) ou des séquences avec des amorces incompatibles ont été omises. Afin de calculer les mesures de diversité en aval (indices de diversité alpha et bêta, analyse Unifrac), les unités taxonomiques opérationnelles (OTU) d'ARNr 16S ont été définies à ≥ 97 % d'homologie de séquence et les séquences chimériques ont été supprimées à l'aide de Chimera Slayer30. Toutes les lectures ont été classées au rang taxonomique le plus bas possible à l'aide de QIIME et d'un ensemble de données de référence de GreenGenes (version 13.5, mai 2013, http://greengenes.secondgenome.com), mais en général, le niveau familial était l'unité taxonomique la plus basse prise en compte tout au long de l'étude. . Les OTU ont été attribuées à l'aide d'uclust en utilisant le script pick_de_novo_otus.py fourni avec QIIME et exporté au format BIOM pour les analyses en aval31. Différentes métriques de diversité alpha (Chao, Observed Species, Shannon et Simpson) ont été calculées à partir des tableaux au format BIOM à l'aide du script alpha_diversity.py fourni par QIIME.

Les profils des gènes de l'ARNr 16S avant ou après l'extraction par gradient de densité ont été évalués à quatre niveaux taxonomiques (phylum, classe, ordre et famille). Les échantillons ont été classés en fonction de leurs profils microbiens à l'aide de trois analyses multivariées différentes et non supervisées, l'analyse en composantes principales (PCA), l'analyse en coordonnées principales (PCO) et l'analyse des correspondances (CA), implémentées dans le logiciel PAST v3.032. Après commande, les échantillons ont été classés selon le type d'échantillon utilisé pour l'extraction de l'ADN (fèces versus microbiote séparés sur gradient de densité Nycodenz®). Différents tests statistiques ont été menés sur les données multivariées, dont One-way ANOSIM et One-way PERMANOVA, chacun avec 9 999 permutations. Afin d'évaluer les différences dans les groupes taxonomiques uniques, les tableaux OTU au format BIOM ont été regroupés aux quatre niveaux taxonomiques, exportés au format texte délimité par des tabulations et analysés à l'aide de STAMP v2.0.333. L'association des taxons au type d'échantillon utilisé pour l'extraction de l'ADN a été évaluée en exécutant des tests de Welch bilatéraux sur chaque paire de moyennes. La correction du taux de fausses découvertes34 a finalement été appliquée et les différences significatives de taxons entre les deux conditions expérimentales n'ont été considérées qu'en dessous d'une valeur p de 0,05 et d'une valeur q inférieure à 0,2, comme dans les travaux précédents17,35. Enfin, une matrice de similarité utilisant l'indice de Jaccard a été obtenue pour tous les échantillons au niveau de la famille en utilisant PAST v3.0. Les similitudes entre les échantillons ont été représentées dans des dendrogrammes construits avec la méthode Simple Linkage ou avec l'algorithme Neighbor Joining (utilisant 9 999 répétitions).

Au cours des dernières années, l'intérêt croissant pour la compréhension de la composition du microbiote intestinal humain a conduit à une meilleure connaissance de la manière dont ces populations microbiennes peuvent être altérées dans le cadre de certaines maladies, notamment celles à composantes auto-immunes ou inflammatoires. Le microbiote intestinal commence à être considéré comme un organe dynamique du corps humain et, à ce titre, susceptible d'être transplanté à des fins thérapeutiques. Dans toutes les voies et modes d'administration rapportés de la FMT, les matières fécales (fraîches ou congelées) sont diluées dans une solution saline, ou lyophilisées, généralement sous atmosphères non contrôlées.

La séparation des microbes des matières fécales à l'aide de méthodologies basées sur le gradient de densité n'est pas un nouveau concept, car il est utilisé pour séparer les bactéries du sol depuis les années 1970. Les premiers protocoles de séparation consistaient en des étapes répétées de mélange-centrifugation dans différents tampons et solutions salines36,37. Plus tard, des séparations bactériennes par centrifugation sur des gradients de saccharose modifiés38, ou par passage sur résine échangeuse de cations (Jacobsen et Rasmussen, 1992) ont été proposées39. La principale limitation de ces protocoles est qu'ils prennent du temps et sont donc difficiles à mettre en œuvre dans les analyses de routine ; cette limitation est surmontée en utilisant la résine Nycodenz25, bien qu'aucune donnée sur la viabilité bactérienne ne soit donnée. Dans le cadre de la FMT, séparer le microbiote gastro-intestinal du reste des matières fécales offre l'avantage de réduire les soucis d'hygiène dus à la nature peu attrayante des matières fécales.

Dans ce travail huit échantillons fécaux issus d'un précédent travail de recherche portant sur la dysbiose intestinale dans le cadre du SLE17, ont été choisis. Ces échantillons étaient divergents en ce qui concerne la diversité bactérienne, comme en témoignent les différentes valeurs du rapport Firmicutes sur Bacteroidetes (FBR, inférieur chez les patients atteints de LES par rapport aux témoins sains ; HC4 = 8,6, HC32 = 8,8, HC33 = 4,5, SLE2 = 1,6, SLE12 = 1,0, ELS13 = 1,6, ELS21 = 1,2, ELS22 = 0,3). Fait intéressant, des changements dans le FBR ont été observés dans certains troubles humains tels que la maladie de Crohn, le diabète humain de type 2 ou l'obésité. La justification de ce choix était d'évaluer si notre méthode d'extraction pouvait interférer dans des échantillons avec différents FBR.

Dans notre approche, une dilution fécale homogénéisée a été chargée au-dessus d'une solution de Nycodenz® à 80 % p/v (Fig. 1A) et centrifugée à 10 000 × g. Cela différait de l'approche de Rooijers et al.40, qui suivait la méthodologie de Murayama et al.41, avec différentes préparations de gradient Nycodenz® et différentes valeurs de force centrifuge relative. Le microbiote a été séparé du reste de la matière fécale en une seule étape de centrifugation. Comme on peut le voir sur la figure 1B, deux couches correspondant à la biomasse microbienne ont été observées au sommet de la couche de débris insolubles. Ces débris ont facilité la tâche de récupération des micro-organismes une fois la phase supérieure de débris solubles éliminée, car ils offraient une barrière physique évitant le mélange du microbiote remis en suspension avec la couche inférieure de Nycodenz®. Les différentes couches ont été soumises à une microscopie en phase de contraste et la grande majorité des micro-organismes ont été observés dans les deux couches mentionnées ci-dessus (Fig. 1C).

L'approche utilisée pour évaluer l'efficacité de la procédure d'extraction Nycodenz® a montré que la viabilité du microbiote fécal séparé avec le gradient de densité était maintenue dans une bonne mesure par rapport au microbiote fécal frais (Suppl. Fig. 1). En moyenne, dans le microbiote récupéré après le traitement au Nycodenz®, 66,9 % des bactéries étaient encore vivantes, avec des valeurs comprises entre 71,3 et 60,6 % (66,9 ± 5,6) parmi les trois échantillons fécaux analysés, tandis que dans les matières fécales fraîches, la viabilité a été estimée à varie entre 85,6 et 49,9 % (68,6 ± 17,9). Cela donne une idée de la bonne efficacité de la méthodologie proposée pour la concentration et l'isolement du microbiote viable, quelle que soit la variation des matières fécales en termes d'humidité et de teneur en fibres. Les concentrations de bactéries vivantes dans les trois échantillons analysés par cytométrie en flux variaient entre 3,2 × 109 et 7,2 × 109 (5,2 ± 2,0 × 109) bactéries/gramme de matière sèche fécale dans les échantillons originaux de matières fécales fraîches et entre 5,7 × 109 et 9,0 × 109 (7,0 ± 1,8 × 109) par gramme de matières fécales après extraction par gradient de densité. Cela signifie que toutes les bactéries viables sont extraites de la matière fécale, avec un rendement d'environ 1010 bactéries viables pour deux grammes d'échantillon fécal. Aucune différence significative n'a été trouvée dans les concentrations moyennes avant et après le traitement. Ainsi, nos résultats ont montré une variabilité minimale du microbiote viable récupéré parmi les différents donneurs individuels et aucun impact du protocole d'isolement sur l'intégrité des bactéries fécales.

L'analyse des fractions de microbiote extraites à l'aide du gradient de densité a entraîné une diminution globale de la diversité par rapport aux résultats obtenus à partir de l'ADN extrait directement des matières fécales. Cela était vrai lorsque des indices de diversité alpha qui ne prennent en compte que la richesse spécifique (Chao 1, Observed Species) étaient calculés, mais le contraire a été observé lors de l'utilisation de l'indice de Shannon, qui prend en compte la régularité des espèces (Shannon) (Fig. 2) . Aucune différence de diversité alpha n'a été détectée à l'aide de l'indice de Simpson. Globalement, cela signifie que bien que le nombre d'OTU récupérées soit plus faible après l'extraction au Nycodenz®, les proportions entre elles n'ont pas nécessairement varié au cours du processus d'extraction. Des précautions doivent être prises dans le sens où les réductions de la diversité alpha pourraient affecter l'efficacité de la FMT, car des groupes bactériens précis importants pour l'équilibre de la dysbiose pourraient être perdus. De cette manière, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si la réduction des OTU/espèces pourrait être en partie due à l'exposition à l'oxygène lors de la manipulation de la séparation du microbiote dans le gradient de densité. Il est possible que des types microbiens particuliers, plus sensibles à l'oxygène, soient protégés si l'extraction du microbiote fécal est réalisée dans des conditions anaérobies strictes. Il sera également intéressant d'élucider si les gradients de Nycodenz® sont utiles pour éliminer sélectivement les molécules/micro-organismes indésirables des matières fécales, telles que les toxines, les prions et les virus.

Différents indices de diversité alpha obtenus à partir des échantillons de selles avant (gris foncé) ou après (gris clair) séparation du microbiote par gradient de densité.

Les barres représentent la moyenne ± l'écart type. (*p < 0,05 ; ***p < 0,001).

Afin de savoir si les différences observées dans la diversité microbienne entre les échantillons, avec ou sans extraction au Nycodenz®, pouvaient être utilisées à des fins de regroupement, les échantillons ont été ordonnés en utilisant la composition taxonomique au niveau du Phylum ou de la Famille à travers différentes méthodologies : Analyse en Composantes Principales ( PCA), l'analyse des coordonnées principales (PCoA) et l'analyse des correspondances (CA) (Fig. 3). Lorsqu'elles sont utilisées de manière impartiale, c'est-à-dire sans fournir d'informations sur la source des différents profils microbiens, toutes les méthodes de commande ont pu regrouper les échantillons en groupes séparés (fèces vs microbiote extrait) (Fig. 3). L'absence d'effet de la méthode d'extraction a été soutenue statistiquement, a posteriori, avec l'utilisation de tests non paramétriques tels que One-way ANOSIM et One-way PERMANOVA. Dans les deux cas, les échantillons ont d'abord été classés selon leur origine et leurs similitudes mesurées selon les distances euclidiennes. Les valeurs de p obtenues n'ont pas permis de classer les échantillons en deux groupes (fèces vs microbiote extrait ; ANOSIM à sens unique ; valeur de p 0,733 ; PERMANOVA à sens unique ; valeur de p 0,353).

Différentes méthodologies de classement multivariées non biaisées ont été utilisées afin de déterminer si les populations microbiennes obtenues directement à partir d'échantillons de selles homogénéisées (points noirs) ou à partir du microbiote fécal séparé (carrés gris) se sont regroupées en fonction de leur composition.

Les ellipses représentent la région estimée où 95 % des points de population devaient tomber. Les analyses ont été effectuées au niveau de l'embranchement et de la famille. ACP : Analyse en Composantes Principales ; PCoA, analyse des coordonnées principales ; CA, analyse des correspondances.

Afin d'étudier plus avant l'effet de la séparation microbienne par gradient de densité sur le profilage des gènes ARN 16S, une matrice de similarité utilisant les abondances relatives des familles a été construite en calculant les distances de Jaccard, une méthode déjà utilisée dans d'autres études métagénomiques42. Les échantillons ont été regroupés en utilisant ces distances inter-échantillons selon la méthode de liaison simple, ou via l'algorithme Neighbor Joining et les dendrogrammes correspondants obtenus (Fig. 4). Dans les deux cas, les échantillons dont l'ADN a été extrait après séparation du microbiote, ont été regroupés avec leurs échantillons de fèces correspondants, à l'exception des échantillons LS12 et HD33. Dans ces échantillons, l'effet de l'extraction du microbiote sur les profils métagénomiques était plus élevé, certains groupes montrant des changements drastiques au niveau du phylum ou de la famille (Suppl. Fig. 2). Ces résultats ont confirmé qu'en règle générale, les communautés microbiennes extraites à l'aide de la procédure de centrifugation en gradient de densité sont représentatives de celles présentes dans l'échantillon de selles d'origine.

Dendrogrammes montrant la similarité des échantillons selon les distances de Jaccard ; (A) regroupement par simple liaison ; (B) regroupement à l'aide de Neigbour Joining avec prise en charge de branche (10 000 répétitions). Les suffixes NEW et OLD désignent des échantillons où le microbiote a été ou n'a pas été extrait dans le gradient de densité, respectivement, avant l'extraction de l'ADN.

La séparation des micro-organismes à l'aide d'un gradient de densité Nicodenz® a été introduite pour la première fois pour l'isolement des bactéries du sol par Lindahl et Bakken43. Cette méthode a également été appliquée avec succès dans d'autres systèmes biologiques, comme dans la description du métagénome intestinal du charançon rouge du palmier (Rhynchophorus ferrugineus)44, ou dans l'évaluation de l'expression génique dans des matrices laitières45. La séparation des bactéries de certains composés matriciels peut être très utile pour les applications de biologie moléculaire en aval, car cette étape élimine de nombreux composants inhibant la PCR, tels que les composés humiques ou les substances colorées interférant avec les protocoles d'hybridation par transfert46.

Dans notre travail, il a été montré que l'application de cette méthodologie n'affectait pas la variabilité globale du microbiote extrait et la diversité des bactéries extraites directement du sol ou suite au gradient de Nycodenz® n'était pas significativement différente, à l'exception des γ-Proteobacteria25. Cependant, certains groupes taxonomiques ont montré des variations importantes selon le gradient d'extraction lorsque la totalité des échantillons a été regroupée et analysée (tableau 1). En général, les profils de gènes d'ARNr 16S d'échantillons dans lesquels le microbiote a été extrait dans le gradient de Nycodenz® ont été caractérisés pour des abondances relatives plus élevées du phylum des Firmicutes, ceci étant dû à des récupérations plus élevées de l'ordre des Clostridiales (Suppl. Fig. 3). Plusieurs groupes des divisions Beta, Delta et Epsilon des phylums des Proteobacteria ont également montré des variations significatives selon le traitement, bien que dans une moindre mesure.

En général, la méthodologie présentée dans ce travail offre une méthode simple et directe pour extraire et séparer le microbiote fécal du reste des composants des selles, permettant d'autres améliorations telles que la réalisation de ce processus dans des conditions atmosphériques contrôlées. De plus, cette étape d'extraction peut éliminer certains composés indésirables des matières fécales, mais cela mérite des recherches plus approfondies. Notre approche pourrait être utile pour obtenir un microbiote intestinal représentatif exempt de matières fécales à des fins de stockage à long terme. Cela pourrait également être utile comme première étape pour préserver les communautés microbiennes globales et être utilisé dans un avenir proche dans la conception de produits/véhicules à base de microbiote pour la FMT et de nouvelles biothérapies de restauration intestinale. Cependant, d'autres améliorations de cette méthode sont nécessaires car, par exemple, certaines OTU liées à Clostridium ont été significativement affectées par l'extraction de Nycodenz® et certains membres de ce genre tels que C. scindens peuvent être pertinents dans le traitement de l'ICD47. De plus, des expérimentations animales sont nécessaires afin de montrer que le microbiote extrait selon cette méthode est effectivement greffé chez l'hôte.

Fait intéressant, ce protocole peut être mis à l'échelle permettant le traitement de quantités fécales plus importantes avec des dispositifs centrifuges de plus grande capacité. Par exemple, 430 grammes de matières fécales peuvent être traités à l'aide de rotors oscillants (jusqu'à 30 000 × g) allouant 4 seaux de 1 000 ml, avec un rendement attendu de 1 012 bactéries viables.

En résumé, l'obtention du microbiote représentatif à partir des fèces d'un donneur sain à l'aide du gradient de densité Nycodenz® décrit dans ce travail permettrait la concentration du microbiote intestinal et le maintiendrait séparé du reste des composants des selles, tout en maintenant des niveaux de viabilité élevés. D'une part, Nycodenz® est une molécule sûre, en termes de toxicité humaine, qui peut être facilement éliminée des échantillons lors du processus d'extraction du microbiote. Par rapport aux autres molécules utilisées pour l'isolement par gradient de densité, le composé dense aux rayons X Nycodenz® présente des avantages, tels qu'un effet non inhibiteur sur l'activité de la plupart des enzymes, la compatibilité avec les tests de détermination des protéines et, ce qui est pertinent à cet effet de cet article, il montre une faible toxicité chez l'homme41. D'autre part, le gradient de densité permet la récupération d'un microbiote fécal représentatif et viable et la suppression des micro-organismes/composés indésirables, ainsi que de faciliter le test des échantillons pour les agents dangereux. Cela pourrait permettre le développement d'applications en aval telles que des stratégies thérapeutiques basées sur le microbiote pour la restauration intestinale microbienne, à la fois dans le cadre d'une maladie donnée ou pour d'autres applications.

Comment citer cet article : Hevia, A. et al. Application du gradient de densité pour l'isolement du composant fécal microbien des selles et son utilisation potentielle. Sci. Rep. 5, 16807; doi : 10.1038/srep16807 (2015).

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Cette recherche a été financée par les subventions AGL2010-14952, AGL2013-44039-R, AGL2013-44761-P et BIO2014-55019-JIN du "Plan Estatal de I + D + I" espagnol et par la subvention EM2014/046 du "Plan galego de investigation, innovation et crecemento 2011–2015". Borja Sánchez et Arancha Hevia ont respectivement obtenu un contrat postdoctoral Ramón y Cajal et une bourse FPI du ministère espagnol de l'Économie et de la Compétitivité.

Département de microbiologie et biochimie des produits laitiers, Institut de recherche laitière (IPLA-CSIC), Paseo Río Linares s/n, 33300 Villaviciosa, Asturies, Espagne

Arancha Hevia, Susana Delgado, Abelardo Margolles et Borja Sánchez

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AM et BS ont conçu la recherche. AH, SD et BS ont réalisé les expériences et rédigé le texte principal du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Hevia, A., Delgado, S., Margolles, A. et al. Application du gradient de densité pour l'isolement du composant fécal microbien des selles et son utilisation potentielle. Sci Rep 5, 16807 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16807

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Reçu : 01 avril 2015

Accepté : 20 octobre 2015

Publié: 19 novembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep16807

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