Caractérisation de deux bactériophages lytiques, infectant le complexe Streptococcus bovis/equinus (SBSEC) de ruminant coréen

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9110 (2023) Citer cet article

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Le complexe Streptococcus bovis/equinus (SBSEC) est l'une des plus importantes bactéries du rumen productrices d'acide lactique provoquant une acidose ruminale subaiguë. Malgré l'importance des bactéries ruminales, les bactériophages lytiques (phages) capables d'infecter les SBSEC dans le rumen ont rarement été caractérisés. Par conséquent, nous décrivons les caractéristiques biologiques et génomiques de deux phages lytiques (désignés comme vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21) infectant diverses espèces de SBSEC, y compris le S. ruminicola récemment signalé. Les phages SBSEC isolés étaient morphologiquement similaires aux Podoviridae et pouvaient infecter d'autres genres de bactéries productrices d'acide lactique, notamment Lactococcus et Lactobacillus. De plus, ils ont montré une stabilité thermique et pH élevée, et ces caractéristiques induisent une forte adaptation à l'environnement ruminal, comme le faible pH trouvé dans l'acidose ruminale subaiguë. La phylogénie basée sur le génome a révélé que les deux phages étaient liés au phage C1 de Streptococcus dans le Fischettivirus. Cependant, ils avaient une similarité nucléotidique plus faible et des arrangements génomiques distincts que le phage C1. L'activité bactériolytique des phages a été évaluée à l'aide de S. ruminicola et les phages ont efficacement inhibé la croissance bactérienne planctonique. De plus, les deux phages pourraient empêcher les biofilms bactériens de diverses souches SBSEC et d'autres bactéries productrices d'acide lactique in vitro. Ainsi, les deux phages SBSEC nouvellement isolés ont été classés comme nouveaux membres du Fischettivirus et pourraient être considérés comme des agents de biocontrôle potentiels contre les bactéries SBSEC ruminales et leurs biofilms.

Le complexe Streptococcus bovis/Streptococcus equinus (SBSEC) est un groupe bactérien commensal dans le tractus gastro-intestinal des humains et des animaux domestiques, y compris les vaches, les chèvres et les chevaux1. Le groupe SBSEC a été classé sur la base des caractéristiques phénotypiques de l'espèce, notamment Streptococcus (S.) equinus (synonyme de S. bovis), S. gallolyticus subsp. galloyticus, S. gallolyticus subsp. pasteurianus, S. gallolyticus subsp. macedonicus, S. infantarius subsp. infantarius, S. lutetiensis et S. alactolyticus2. Récemment, une nouvelle espèce, S. ruminicola, isolée de ruminants en Corée du Sud, a été proposée comme nouveau membre aux propriétés biologiques distinctes parmi les souches de ce groupe3. Les (sous-)espèces spécifiques de SBSEC ont provoqué des infections cliniques, telles que l'endocardite infectieuse et la bactériémie avec cancer colorectal. Ils sont également impliqués dans des troubles métaboliques animaux, tels que l'acidose ruminale subaiguë chez les ruminants4,5,6, indiquant ainsi l'importance de ce groupe en tant que pathogènes potentiels.

Les bactériophages (phages) infectent naturellement les bactéries à travers deux cycles de réplication (lytique et lysogène) et ont un ciblage d'hôte à haute spécificité, évitant les perturbations de la communauté du microbiome7. Les attributs uniques des phages en font des antimicrobiens potentiels pour contrôler sélectivement plusieurs bactéries pathogènes. Le biofilm bactérien constitué de substances polymères extracellulaires est très résistant aux antibiotiques, à la chaleur et aux conditions acides, ce qui entraîne une augmentation des bactéries résistantes aux antimicrobiens dans les communautés abiotiques et biotiques8. Il a été rapporté que les phages contrôlent la formation de biofilm et pénètrent dans le biofilm existant à la surface des cellules planctoniques9. Les phages ont été trouvés dans le rumen à environ 108 populations de particules par gramme de contenu du rumen10, mais on sait peu de choses sur les propriétés biologiques de la plupart des phages dans des environnements de culture stricts. Jusqu'à présent, 14 phages infectant Streptococcus spp. ont été taxonomiquement approuvés par le Comité international sur la taxonomie des virus (ICTV ; https://ictv.global/taxonomy), et environ 800 génomes entièrement séquencés, y compris les phages Streptococcus, sont disponibles dans la base de données GenBank. Cependant, les études sur les phages infectant SBSEC sont relativement plus rares que celles des autres Streptococcus sp. malgré l'importance des bactéries ruminales. Un seul génome de l'isolat de phage SBSEC ϕSb01, avec des morphotypes de la famille des Siphoviridae, est actuellement disponible sur le Portail Génomique du Joint Genome Institute11.

Néanmoins, les phages SBSEC font partie des phages les mieux étudiés parmi les virus infectant les bactéries ruminales, comme Ruminococcus albus de la famille des Myoviridae12, et Bacteroides sp. de la famille des Podoviridae13. De plus, plusieurs isolats de phages SBSEC lytiques ou lysogéniques ont été caractérisés morphologiquement et génétiquement14,15,16,17. De plus, l'application possible de l'endolysine à base de prophage à partir d'un génome SBSEC séquencé pour contrôler le microbiote du rumen a été rapportée18. Cependant, à notre connaissance, les phages SBSEC avec des morphotypes de la famille des Podoviridae n'ont pas encore été signalés. Par conséquent, nous rapportons deux phages lytiques capables d'infecter diverses bactéries SBSEC ruminales, y compris le S. ruminicola nouvellement signalé et d'autres genres de bactéries productrices d'acide lactique (par exemple, Lactococcus et Lactobacillus) avec un fort potentiel pour les applications biotechnologiques. Les caractéristiques biologiques et génomiques des deux phages SBSEC (désignés comme vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21) et leur capacité à contrôler les biofilms bactériens ont été examinés. Il s'agit, à notre connaissance, du premier signalement de phages de morphotypes Podoviridae, qui infectent les espèces SBSEC et d'autres bactéries productrices d'acide lactique trouvées dans le rumen des ruminants.

Un total de deux phages SBSEC ont été isolés dans cette étude, et ceux-ci ont été désignés comme vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21. Le phage SBSEC vB_SbRt-pBovineB21 a été isolé à partir d'échantillons fécaux prélevés dans une ferme Hanwoo (Chungcheongnam-do, Corée) et vB_SbRt-pBovineS21 a été isolé à partir d'échantillons d'eaux usées provenant d'une station d'épuration (Daejeon, Corée). En utilisant la méthode de la gélose à double couche, les deux phages isolés ont pu produire des plaques claires sur les pelouses en utilisant la souche S. ruminicola KCTC 43306 de la Collection coréenne pour la culture type (KCTC) comme hôte. L'analyse par microscopie électronique à transmission (MET) a révélé que les phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 ont une tête icosaédrique de 49,2 et 46,2 nm de diamètre, respectivement. Ils présentaient également de courtes queues non contractiles de 13, 3 et 12, 5 nm, respectivement (Fig. 1). En conséquence, les deux phages ont été morphologiquement classés comme membres de la famille des Podoviridae. L'analyse de la gamme d'hôtes des phages isolés a révélé que parmi les souches de S. equinus, la lyse était plus faible pour les isolats de Bos taurus (15,4 %) et de Bos taurus coreanae (35,3 %). Cependant, la plupart des isolats de Capra aegagrus hircus, y compris S. ruminicola (100 %), S. equinus (64,3–71,4 %) et S. lutetiensis (100 %) ont été lysés par ces phages (tableau 1). Aucune lyse n'a été observée dans les neuf souches types de SBSEC et S. agalactiae. Notamment, les deux phages pourraient infecter toutes les souches types des autres genres, Lactobacillus spp. et Lactococcus lactis subsp. lactis, utilisé dans cette étude.

Micrographies électroniques à transmission des phages SBSEC isolés. ( a ) L'image TEM de vB_SbRt-pBovineB21phage montrant une tête icosaédrique (49, 2 nm) et une courte queue non contractile (13, 3 nm) est indiquée par une flèche noire. ( b ) L'image TEM du phage vB_SbRt-pBovineS21 montrant une tête icosaédrique (46, 2 nm) et une courte queue non contractile (12, 5 nm) est indiquée par une flèche noire. La barre d'échelle est de 50 nm.

Plus de 80% des phages SBSEC libres ont diminué en environ 15 minutes, ce qui indique que les phages ont été adsorbés efficacement sur la souche hôte (Fig. 2a, b). Le temps de latence et la taille de la salve ont été déterminés à l'aide de la courbe de croissance en une étape des phages isolés contre S. ruminicola KCTC 43306 à la multiplicité optimale d'infection (MOI) de 0,0001. Le temps de latence et la taille de la rafale du phage vB_SbRt-pBovineB21 étaient respectivement d'environ 20 min et 367, 5 PFU / cellules infectées, comme le montre la figure 2c. De plus, le phage vB_SbRt-pBovineS21 avait un temps de latence et une taille de rafale d'environ 20 min et 198,3 PFU/cellules infectées, respectivement (Fig. 2d).

Taux d'adsorption et courbe de croissance en une étape des phages SBSEC isolés. Les taux d'adsorption des phages vB_SbRt-pBovineB21 (a) et vB_SbRt-pBovineS21 (b) ont diminué à moins de 80 % à 15 min. Les courbes de croissance en une étape des phages vB_SbRt-pBovineB21 (c) et vB_SbRt-pBovineS21 (d) montrent un temps de latence de 20 min et une taille de rafale de 367,5 et 198,3 PFU/mL, respectivement. Dans toutes les expériences, un essai en triple a été réalisé indépendamment en utilisant S. ruminicola KCTC 43,306. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne.

La stabilité des phages SBSEC isolés a été déterminée à différentes températures et valeurs de pH. En ce qui concerne les résultats de stabilité thermique, le phage vB_SbRt-pBovineB21 était relativement stable à 4, 16, 25, 37, 45 et 56 °C pendant 3 h, mais était complètement inactivé après incubation à 80 °C pendant 3 h. Le phage vB_SbRt-pBovineS21 était relativement stable à 4, 16, 25, 37 et 45 °C, mais était complètement inactivé après incubation à 56 et 80 °C pendant 3 h (Fig. 3a). Les résultats de stabilité du pH ont révélé que les deux phages ont survécu à une plage de pH de 3 à 12 et ont été complètement inactivés à pH 2, suggérant ainsi qu'aucun phage ne pouvait survivre dans les environnements fortement acides et alcalins (Fig. 3b).

Stabilité des phages SBSEC isolés dans différentes conditions thermiques et de pH. ( a ) La stabilité thermique des deux phages isolés à 4, 16, 25, 37, 45, 56 et 80 ° C. ( b ) La stabilité au pH des phages isolés à pH 2, 3, 4, 4, 6, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 et 12. Toutes les expériences ont été menées indépendamment en triple. Les lignes verticales indiquent l'erreur type de la moyenne. Les barres marquées des mêmes lettres n'indiquent aucune différence significative (p < 0,05).

Les effets bactériolytiques des phages SBSEC isolés contre S. ruminicola KCTC 43306 ont été comparés à différents MOI. Comme présenté à la Fig. 4, les valeurs de densité optique (DO; 600 nm) de tous les MOI (0, 001, 0, 01, 0, 1, 1 et 10) ont rapidement augmenté au cours des 2 premières heures. Par la suite, les valeurs de DO 600 nm des groupes traités avec le phage étaient considérablement inférieures à celles du témoin positif (MOI de 0). Dans les deux phages, les valeurs de DO 600 nm des groupes traités avec le phage ont été maintenues (MOI de 0,001, 0,01, 0,1 et 1) ou constamment diminuées (MOI de 10) jusqu'à 10 h après l'inoculation du phage, indiquant ainsi que la croissance de les cellules hôtes ont été efficacement inhibées par le phage.

Les effets bactériolytiques des phages SBSEC isolés aux différentes MOI. Activités de lyse cellulaire des phages vB_SbRt-pBovineB21 (a) et vB_SbRt-pBovineS21 (b) à un MOI de 10, 1, 0,1, 0,01 et 0,001 contre S. ruminicola KCTC 43 306 et sans phage utilisé comme contrôle. Chaque expérience a été menée indépendamment en triple exemplaire. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne.

Le génome des phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 comprenait un ADN double brin linéaire de 16 260 bp et 17 280 bp de longueur avec une teneur en G + C de> 33% et prédisait 27 et 26 cadres de lecture ouverts (ORF), respectivement . Les cartes du génome sont présentées aux Fig. 5a et Fig. 5b. Dans les deux phages, 10 ORF ont été prédits comme protéines fonctionnelles, y compris la protéine d'encapsidation, l'ADN polymérase, les protéines associées au système de lyse putative, la protéine de queue de phage, la protéine de fibre de queue, l'adaptateur tête-à-queue, la protéine du collier supérieur et la protéine de capside majeure. De plus, 13 domaines conservés ont été détectés dans des ORF prédits de manière fonctionnelle sur la base de comparaisons d'homologie de protéines d'origine phagique. Plus de 10 ORF dans les phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 étaient similaires (identités d'acides aminés; 25, 5 à 63, 6%) aux protéines prédites du phage C119 de Streptococcus. De plus, plus de quatre ORF étaient similaires (identités d'acides aminés < 45 %) à d'autres phages Podoviridae disponibles dans la base de données GenBank, ce qui indique que les phages SBSEC isolés possèdent des structures génomiques uniques. Les ORF restants ont été prédits comme des protéines hypothétiques, avec des protéines inconnues annotées à l'aide de recherches BLASTP. De plus, des domaines transmembranaires ont été prédits dans trois ORF et aucun peptide signal n'a été prédit dans tous les ORF des deux phages (tableaux supplémentaires 1 et 2). Les gènes d'ARNt et les gènes associés à la virulence bactérienne et à la résistance aux antimicrobiens n'ont pas été détectés dans les génomes des deux phages isolés. L'analyse PhageTerm devait être permutée avec des extrémités redondantes dans les phages isolés. En particulier, les génomes des phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 présentaient de fortes similitudes avec 18 ORF prédits et 13 protéines fonctionnelles putatives divisées en quatre groupes fonctionnels : deux métabolismes nucléotidiques, quatre structures virales et conditionnement, quatre lyses et trois structures de queue. Cependant, les deux phages différaient nettement dans les gènes présents dans les régions intergéniques entre l'ORF 13 et l'ORF 15. Dans le phage vB_SbRt-pBovineS21, l'ORF 14 (171 bp) et l'ORF 15 (232 bp) étaient situés à côté de l'ORF 13, codant pour une queue protéine de 583 pb d'affilée ; cependant, l'ORF 14 présenté dans le phage vB_SbRt-pBovineS21 n'a pas été détecté dans le phage vB_SbRt-pBovineB21 (Fig. 6).

Cartes génomiques des phages SBSEC isolés. Les cartes circulaires du génome des phages vB_SbRt-pBovineB21 (a) et vB_SbRt-pBovineS21 (b) indiquent chaque ORF prédit en couleur en fonction des catégories fonctionnelles : protéine hypothétique (bleu), système de lyse (rose) et protéine associée au phage supplémentaire ( orange). La voie intérieure, jaune-vert, représente l'homologie blastique des génomes de Streptococcus phage C1 (AY212251.1). Le contenu GC, le GC Skew positif et le GC skew négatif sont respectivement indiqués en noir, vert et violet.

Comparaisons génomiques des phages SBSEC isolés et du phage C1 de Streptococcus. La visualisation linéaire est représentée par des régions codantes de génomes de phages avec des flèches colorées. Les ORF annotés de manière fonctionnelle en relation avec les protéines associées aux phages, telles que la structure et l'emballage, la réplication de l'ADN, la lyse de l'hôte et la protéine hypothétique, étaient colorés en bleu, rose, jaune et noir. De plus, la similarité de séquence est indiquée par l'intensité du gris.

La comparaison du génome séquencé des phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 à d'autres phages actuellement disponibles dans la base de données GenBank a suggéré que les phages isolés étaient les plus similaires au Streptococcus phage C1 (AY212251.1) avec < 77 % d'identité basée sur < 2 % de couverture des requêtes (tableau supplémentaire 3). Par conséquent, sur la base des normes de classification proposées par l'ICTV20, les phages isolés ont été classés dans la famille des Rountreeviridae (tableau supplémentaire 4). De plus, sur la base de la similitude avec la séquence d'acides aminés, une analyse génomique comparative a été effectuée entre les phages SBSEC isolés et le phage C1 à l'aide d'Easyfig. L'analyse a révélé que le contenu génomique global et les arrangements des phages SBSEC étaient similaires à ceux du phage C1, le seul membre du genre Fischettivirus dans la famille des Rountreeviridae. Cependant, les phages SBSEC ont montré plusieurs différences par rapport au phage C1 : (i) Bien que la plupart des gènes ayant des fonctions similaires aient été localisés séquentiellement dans le génome de trois phages, les gammes d'identité d'acides aminés des ORF prédits dans les phages SBSEC contre phage C1 étaient inférieurs à 63,6 %. (ii) Bien que les phages SBSEC possédaient un système de lyse de l'hôte similaire (holin-plyCB-lil-plyCA) au phage C119, les quatre gènes (lil (ORF 10 et ORF 9), plyCB (ORF 11 et ORF 10), holin (ORF 12 et ORF 11) et plyCA (ORF 13 et ORF 12)) ont été trouvés inversement insérés dans les génomes séquencés et les emplacements internes de holin et lil ont été modifiés autour de plyCB (Fig. 6). Ainsi, les preuves génomiques soutiennent fortement que Les phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 sont nettement différents du phage Cl et sont donc considérés comme de nouvelles espèces. Pour déterminer la position taxonomique des phages SBSEC vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21, des analyses phylogénétiques et des comparaisons de dot plot ont été réalisées en utilisant les séquences complètes du génome des deux phages isolés et de 30 autres phages appartenant à la famille des Rountreeviridae (tableau supplémentaire 4). Bien que les deux phages SBSEC aient été regroupés avec le phage Streptococcus C1, les phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 ont été séparés en différentes sous-branches, comme le montre la Fig. 7. Des analyses phylogénétiques supplémentaires utilisant des protéines fonctionnelles, y compris la principale protéine de capside (Fig supplémentaire 1a) et l'ADN polymérase (Fig. 1b supplémentaire) ont également révélé des résultats cohérents avec l'analyse cladistique basée sur le génome. De plus, l'identité nucléotidique moyenne estimée à l'aide d'OrthoANI entre les phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 était de 89, 8%, et la carte thermique résultante ne suggérait aucun regroupement pour les deux phages SBSEC et Streptococcus phage C1 (Fig. 8). Sur la base de ces résultats, les phages SBSEC nouvellement isolés pourraient être considérés comme de nouvelles espèces du genre Fischettivirus.

Analyse phylogénétique des phages SBSEC isolés basée sur le génome complet séquencé. L'arbre phylogénétique et le diagramme de points indiquent que les deux phages se regroupent avec le phage C1 de Streptococcus en tant que nouveaux membres du genre Fischettivirus. Les cases colorées sont représentées par des membres de la sous-famille Rakietenvirinae (violet), de la sous-famille Sarlesvirinae (vert), du genre Fischettivirus (jaune) et du genre Negarvirus (rose), respectivement, appartenant à la famille Rountreeviridae. Les phages utilisés dans cette étude sont mis en évidence en gras. Le groupe externe est le phage Lactobacillus KSY1 (DQ535032.1).

Carte thermique des phages SBSEC isolés isolés dans cette étude. La carte dessinée à l'aide des valeurs ANI de 29 génomes, y compris les phages isolés SBSEC et Rountreeviridae, démontre le regroupement basé sur la similarité intergénomique. Les phages utilisés dans cette étude sont indiqués en gras.

Pour évaluer l'effet des phages sur la formation de biofilm SBSEC, S. ruminicola KCTC 43 306 a été incubé avec différents titres de suspension de phage. Les résultats du test de prévention du biofilm ont indiqué que les deux phages à différentes concentrations (109, 108, 107, 106 et 105 PFU/mL) réduisaient régulièrement la biomasse totale par rapport à celle du groupe témoin (Fig. 9a et 9b). Dans vB_SbRt-pBovineB21, la viabilité de la cellule hôte a été réduite de 5 logs UFC/mL dans le biofilm formé après 24 h d'incubation, atteignant une réduction maximale de 2 log UFC/mL après 48 h (Fig. 9c). Dans vB_SbRt-pBovineS21, une réduction progressive de la formation de biofilm a été observée. Les cellules viables ont diminué de 4 logs UFC/mL par rapport au témoin après 24 et 48 h d'incubation (Fig. 9d). Les effets lytiques des phages sur les biofilms et la présence de cellules viables ont également été analysés à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (CLSM) et les phages ont montré le potentiel de contrôler le biofilm formé par S. ruminicola (Fig. 9e). La capacité potentielle de prévention du biofilm des phages a également été évaluée à l'aide d'un total de cinq autres souches sensibles aux phages (S. infantarius subsp. infantarius ATCC BAA-102 T, S. gallolyticus subsp. gallolyticus DSM 16831 T, S. equinus KCCM 90,374, S. ruminicola KCTC 43308 T et L. lactis sous-espèce lactis KCCM 41572 T) qui ont montré une production de biofilm relativement plus élevée (données non présentées). Les résultats ont indiqué que les phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 étaient très efficaces pour prévenir la formation de biofilm des cinq souches sélectionnées avec une dose relativement faible de concentration de phages (107 PFU/ml) pendant 24 h (Fig. 10).

Capacité de prévention du biofilm des phages SBSEC isolés. Les effets des phages vB_SbRt-pBovineB21 (a) et vB_SbRt-pBovineS21 (b) sur la biomasse totale de formation de biofilm à différentes concentrations pendant 24 et 48 h. Les effets des phages vB_SbRt-pBovineB21 (c) et vB_SbRt-pBovineS21 (d) sur des cellules bactériennes viables de biofilms à différentes concentrations pendant 24 et 48 h. Le témoin était une culture bactérienne sans phage. Chaque expérience a été menée indépendamment en triple exemplaire en utilisant S. ruminicola KCTC 43,306. Les valeurs marquées par les différentes lettres indiquent des différences significatives (p < 0,05). (e) Images CLSM du biofilm de S. ruminicola KCTC 43 306 traité avec deux phages isolés (107 PFU/mL) pendant 24 et 48 h. La fluorescence verte observée à l'aide de Syto 9 dans les images indique des cellules vivantes. La barre d'échelle est de 100 μM.

Capacité de prévention du biofilm des phages SBSEC isolés contre les cinq souches bactériennes utilisées dans cette étude. ( a ) Les effets des phages vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21 sur la biomasse totale de la formation de biofilm à 107 PFU/mL pendant 24 h. Le témoin était une culture bactérienne sans phage. Les valeurs tracées dans le graphique de la boîte et des moustaches à l'aide de GraphPad Prism 7 ont révélé tous les points ainsi que le minimum et le maximum. Chaque expérience a été réalisée indépendamment en triple exemplaire. ( b ) Images CLSM du biofilm de cinq souches bactériennes sélectionnées traitées avec les deux phages isolés (107 PFU / mL) pendant 24 h. La fluorescence verte observée à l'aide de Syto 9 indique des cellules vivantes. La barre d'échelle est de 100 μM.

SBSEC est une bactérie commensale qui habite le tractus gastro-intestinal des animaux et des humains; cependant, sa prolifération agit comme un déclencheur de l'acidose lactique subaiguë chez les ruminants. De plus, plusieurs espèces représentatives connues pour être pathogènes chez les patients atteints de maladies infectieuses ont également été signalées. Récemment, un nouveau membre de SBSEC, S. ruminicola, a été proposé par notre groupe3. Néanmoins, on sait peu de choses sur la biodiversité de SBSEC et des phages infectant ce complexe bactérien. Il s'agit de la première étude à rapporter les propriétés biologiques et génétiques des deux phages lytiques infectant des SBSEC représentatifs, conduisant ainsi au contrôle potentiel du microbiote ruminal (tableau 2). Les phages isolés ont largement infecté les SBSEC des souches types et des isolats sauvages du rumen21. Fait intéressant, les phages isolés ont montré une large activité lytique contre d'autres bactéries productrices d'acide lactique, telles que Lactobacillus spp.22,23 et Lactococcus sp.24, qui produisent rapidement de l'acide lactique dans le rumen25. Ce résultat suggère que les phages nouvellement isolés peuvent avoir le potentiel d'empêcher l'accumulation excessive de lactate produit par les bactéries prédominantes du rumen lors de troubles métaboliques.

Les caractéristiques morphologiques des phages SBSEC isolés étaient similaires à celles du phage C119 de Streptococcus, qui appartenait autrefois à la famille des Podoviridae et est actuellement membre des Rountreeviridae, selon la taxonomie de l'ICTV20. De plus, les caractéristiques lytiques des phages SBSEC isolés ont montré une activité antibactérienne efficace contre SBSEC, après que les deux phages ont adsorbé les bactéries hôtes en 15 minutes. Le temps de latence, défini comme le temps entre l'adsorption et le début de la lyse des cellules bactériennes, était de 20 min. De plus, la taille de la rafale, définie comme le nombre de phages libérés par la cellule hôte infectée, était de 198 à 367,5 PFU par cellule infectée. Ces résultats ont indiqué que les phages isolés présentaient une adsorption rapide, une période de latence plus courte et une taille de rafale significativement plus grande que celle du phage Enterococcus vB_EfaP_IME195 avec 30 min et environ 120 PFU/cell26, du phage Staphylococcus CSA13 avec 20 min et environ 230 PFU/ mL27 dans la famille des Rountreeviridae et Streptococcus phage Cp-1 avec 50 min et environ 9 PFU/mL28 dans la famille des Salasmaviridae.

La stabilité des phages isolés dans diverses conditions environnementales (y compris difficiles), telles que la température et le pH, est une propriété importante pour les utiliser comme agents de lutte biologique potentiels. Les deux phages SBSEC isolés étaient relativement stables entre 4 et 45 °C, suggérant leur adaptation à l'activité métabolique dans l'environnement du rumen à environ 38 °C29. De plus, les deux phages étaient stables à un pH compris entre 3 et 12, indiquant une forte tolérance au pH pour les environnements extrêmement acides et alcalins. Les conditions de pH pour l'activité optimale des bactéries dégradant l'amidon dans le rumen se situent entre 5,4 et 630, et les conditions d'acidose subaiguë ruminale doivent être maintenues entre pH 5,2 et 631. Ces résultats sont significatifs, en raison de la capacité des phages isolés à survivre à un pH bas, ce qui peut prévenir l'acidose ruminale causée par les bactéries productrices d'acide lactique, y compris la SBSEC, chez les ruminants. De plus, la stabilité environnementale des phages isolés était cohérente avec celle du phage Escherichia coli isolé des excréments de bovins, qui a signalé une tolérance optimale entre 37 et 40 ° C et un pH de 6, 3 à 8, respectivement32. Les effets bactériolytiques ont été présentés comme une réduction de 2 log UFC/mL en 2 h au MOI le plus bas de 0,001 par rapport au groupe témoin. Cela aggrave efficacement la survie des bactéries hôtes à de très faibles concentrations et est avantageux pour des applications potentielles.

Les caractéristiques génomiques des deux phages SBSEC étaient les plus similaires à celles du phage Streptococcus C119. Cependant, les phages nouvellement isolés ont montré plusieurs caractéristiques génomiques différentes par rapport au phage C1 et peuvent être classés comme nouveaux membres dans le genre Fischettivirus comme suit : Premièrement, le génome des deux phages SBSEC a globalement démontré une identité relativement faible (< 77 %) à le niveau de nucléotide avec une couverture de 2 % et des arrangements génomiques distincts par rapport au phage C1. Deuxièmement, seulement la moitié de tous les ORF prédits dans les deux phages SBSEC ont été annotés en tant que protéines hypothétiques. Chacune des trois protéines (ORF 7, ORF 11 et ORF 20 dans le phage vB_SbRt-pBovineB21 et ORF 6, ORF 10 et ORF 20 dans le phage vB_SbRt-pBovineS21) a été prédite pour coder des gènes associés au phage. Troisièmement, les deux phages SBSEC possédaient des systèmes de lyse bactérienne similaires mais distincts du phage C1. Il a été rapporté que le phage C1 de Streptococcus possède une nouvelle lysine, PlyC, composée de deux structures spécifiques identifiées comme plyCA et plyCB, qui codent respectivement pour les domaines catalytique et de liaison à la paroi cellulaire19,33,34. Les génomes séquencés des phages nouvellement isolés dans cette étude ont également codé deux protéines putatives chacune (ORF 11 et ORF 13 dans vB_SbRt-pBovineB21 ; ORF 10 et ORF 12 dans vB_SbRt-pBovineS21) avec des domaines conservés, prédits comme plyCA et plyCB. Néanmoins, les gènes prédits présentaient une faible homologie et une distinction d'arrangement avec le phage C1 (Fig. 6). Ces résultats ont révélé que les phages SBSEC nouvellement isolés ont des systèmes de lyse différents de celui du phage C1. Ainsi, des études supplémentaires sur les caractéristiques détaillées de l'activité potentielle des enzymes associées à la lysine dérivées des phages isolés sont nécessaires pour confirmer leur caractère unique dans notre future analyse.

A ce jour, on sait peu de choses sur la présence et le rôle exact des biofilms provoqués par les SBSEC. Plusieurs souches de S. galloyticus, y compris trois sous-espèces connues comme agents pathogènes responsables de l'endocardite infectieuse, ont une capacité de formation de biofilm plus élevée et sont significativement associées à la résistance aux antibiotiques35,36. Cependant, les capacités de production de biofilm de certaines souches de S. lutetiensis et S. infantarius subsp. infantarius isolé des produits laitiers pourrait être considéré comme une caractéristique avantageuse36. Semblable aux souches SBSEC susmentionnées, la souche hôte KCTC 43 306 pourrait produire un biofilm et nous avons pu confirmer la présence d'une activité anti-biofilm dans les phages isolés qui peuvent réduire efficacement la formation de biofilm et les cellules bactériennes viables dans les biofilms. Fait intéressant, la formation de biofilms de cinq souches de SBSEC et de L. lactic subsp. lactis a également été prévenu par l'inoculation du phage (Fig. 10). Une étude a rapporté que le phage qui était efficace pour réduire les biofilms avait une gamme d'hôtes plus large que ceux infectant les cellules bactériennes elles-mêmes37, suggérant ainsi que les phages SBSEC nouvellement isolés auront un fort potentiel pour contrôler la formation de biofilms d'espèces bactériennes plus diverses dans le rumen. . Par conséquent, les phages SBSEC isolés pourraient être reconnus comme ceux ayant un potentiel anti-biofilm et une efficacité dans la prévention des biofilms de bactéries productrices d'acide lactique. Sur la base des génomes des phages nouvellement isolés, la dépolymérase dérivée du phage n'a pas été directement identifiée comme une enzyme qui contrôle spécifiquement la formation de biofilm bactérien. Cependant, les protéines de queue codées dans les génomes des phages vB_SbRt-pBovineB21 (ORF 14 et ORF 16) et vB_SbRt-pBovineS21 (ORF 13 et ORF 16) peuvent être une dépolymérase putative, qui a été trouvée dans la protéine de fibre de queue ou la protéine de pointe de queue38 ,39. En conséquence, d'autres études sont justifiées pour étudier les mécanismes détaillés de l'activité anti-biofilm des phages dans notre future analyse. Il s'agit, à notre connaissance, de la première étude qui rapporte les propriétés biologiques et génétiques des phages lytiques infectant les représentants de la SBSEC, entraînant ainsi un potentiel de contrôle du microbiote ruminal (Tableau 2).

Cette étude fournit des informations biologiques et génétiques sur deux nouveaux phages lytiques (vB_SbRt-pBovineB21 et vB_SbRt-pBovineS21) infectant diverses espèces (ou sous-espèces) de la SBSEC ruminale. Sur la base de leurs propriétés morphologiques et génétiques, les deux phages peuvent être désignés comme de nouvelles espèces de Fischettivirus. De plus, des analyses comparatives du génome ont révélé leur caractère unique par rapport à d'autres phages Streptococcus connus. La large activité lytique des phages isolés a révélé leur potentiel en tant qu'agents de lutte biologique contre les SBSEC et les bactéries productrices d'acide lactique qui provoquent des troubles métaboliques chez les animaux et les humains. Pour résumer, les phages nouvellement isolés peuvent améliorer la sécurité et la stabilité du microbiote ruminal en tant qu'agents de biocontrôle alternatifs.

Au total, 59 souches SBSEC (51 isolats et 8 souches), S. agalactiae KCCM 11957 T, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3108 T, Lactobacillus sakei KCCM 40264 T, Lactobacillus casei KCCM12452T et Lactococcus lactis subsp. lactis KCCM 41572 T ont été utilisés dans cette étude, comme indiqué dans le tableau 1. Parmi les 59 souches SBSEC utilisées dans cette étude, 51 ont été précédemment identifiées comme membres SBSEC sur la base de l'analyse de la séquence du gène sodA et leur diversité génétique potentielle a été déterminée21. Toutes les souches ont été cultivées dans de la gélose tryptique soja (TSA; Difco, USA) à 37 ° C pendant 24 h et stockées dans du bouillon tryptic soja (TSB; Difco, USA) avec 10% de glycérol à -80 ° C jusqu'à utilisation.

La souche bactérienne hôte utilisée pour l'isolement du phage dans cette étude était S. ruminicola KCTC 43 306, qui a récemment été signalée comme une nouvelle SBSEC3. Des échantillons ont été prélevés à partir de matières fécales bovines et d'eaux usées pour isoler les phages SBSEC. En bref, la souche hôte cultivée en phase exponentielle dans le TSB a été co-cultivée avec des quantités égales des échantillons collectés à 37 ° C pendant 24 h sous agitation. Les mélanges ont été centrifugés à 10 000 × g pendant 20 min et filtrés avec un filtre seringue de 0,45 μm (Millex, Merck Millipore Ltd., Irlande). Des dilutions en série du filtrat dans de l'eau distillée ont été préparées et étalées sur de la gélose molle TSB à 0,7 % contenant 1 ml de culture de la souche hôte avec une DO 600 nm de 0,3. Ce processus a été répété au moins trois fois pour obtenir des plaques uniques. Par la suite, des phages bien isolés ont été propagés en utilisant la méthode conventionnelle de gélose à double couche40 et stockés à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.

La morphologie des phages SBSEC isolés a été examinée par microscopie électronique à transmission. Pour la coloration négative, les particules de phage propagées (environ 109 PFU/mL) ont été placées sur des grilles de cuivre recouvertes de carbone et laissées à absorber pendant 2 min à température ambiante pour une coloration négative. Les échantillons ont été colorés négativement avec une solution d'acétate d'uranyle à 2 % (p/v) (UrAc ; Electron Microscopy Sciences, Inc., États-Unis) pendant 1 min, suivis d'un transfert d'UrAc, puis ont été observés à l'aide d'un système EM bio-haute tension. (JEM-1400 Plus ; JEOL Ltd., Japon) à une tension d'accélération de 120 kV au Korea Basic Science Institute (KBSI).

Pour déterminer la gamme d'hôtes des phages SBSEC isolés, 60 Streptococcus spp., trois souches de Lactobacillus sp. et une de Lactococcus sp. ont été testés en utilisant la méthode de la gélose à double couche et le test ponctuel. En bref, 10 µL de lysats de phages (environ 109 PFU/mL) ont été déposés sur une plaque de gélose à double couche et ajoutés à 1 mL de la culture de la souche bactérienne. Après incubation à 37 ° C pendant 24 h, la plaque a été observée pour la formation de la zone de lyse.

Le test d'adsorption a été effectué comme décrit précédemment41. Un mélange 1:1 de la souche bactérienne hôte en phase exponentielle (environ 108 UFC/mL) et des lysats de phage à un MOI de 0,0001 a été incubé à 37 °C. Des échantillons (100 µL) ont été prélevés à 0, 5, 10, 13, 15, 17, 20 et 25 min après l'inoculation du phage et centrifugés à 12 000 × g à 4 °C pendant 5 min. Pour déterminer la proportion de phages libres, les surnageants ont été cultivés en triple en utilisant la méthode de la gélose à double couche. Un test de croissance en une étape a été effectué pour déterminer le temps de latence et la taille de la salve, comme décrit précédemment41. Les lysats de phage à un MOI de 0,0001 et la souche hôte à la phase log (environ 108 UFC/mL) ont été co-cultivés en quantités égales à 37 ° C pendant 15 min, permettant l'adsorption sur l'hôte. Le surnageant a été éliminé après centrifugation à 12 000 × g et 4 °C pendant 5 min. Les culots restants ont été remis en suspension dans 10 ml de TSB préchauffé et incubés à 37 ° C sous agitation. Les suspensions (100 µL) ont été recueillies à 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 et 100 min et immédiatement diluées avec de l'eau distillée pour la méthode de gélose à double couche en trois exemplaires.

Pour le test de stabilité thermique des phages SBSEC isolés, 100 µL de lysat de phage (environ 108 PFU/mL) ont été mélangés avec 900 µL de PBS 0,1 M (pH 7,0) et incubés statiquement à 4, 16, 25, 37, 45, 56 et 80 ° C pendant 3 h. Pour le test de stabilité du pH, 100 µL de lysat de phage (environ 108 PFU/mL) ont été ajoutés à une série de tubes contenant 900 µL de solution tampon pH (Samchun Chemicals, Corée) à pH 2, 3, 4, 4,6, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 et 12 et incubés à 4 ° C pendant 3 h. Après incubation de tous les échantillons de test, le titre de phage a été déterminé en triple en utilisant la méthode de gélose à double couche.

Pour évaluer les effets bactériolytiques des phages SBSEC isolés contre le SBSEC, des tests de lyse des cellules hôtes ont été effectués comme indiqué précédemment42. Le TSB (10 ml) a été inoculé avec la souche hôte et incubé à 37 ° C jusqu'à ce que la phase logarithmique soit atteinte. La culture a été inoculée avec des lysats de phages à des MOI de 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 10 à 37 ° C pendant 24 h avec agitation, et le contrôle positif a été utilisé comme MOI de 0. L'absorbance a été déterminée en mesurant à OD 600 nm toutes les 1 h pendant 10 h, qui a été réalisée en triple exemplaire.

L'ADN génomique total extrait par Macrogen (Séoul, Corée) a été séquencé sur la plateforme Illumina HiSeq X-10 (Illumina, États-Unis) en construisant une bibliothèque d'ADN à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN TruSeq Nano (Illumina, États-Unis) et assemblé à l'aide de SPAdes (ver 3.13.0) assembleur de génomes43, utilisant divers k-mers. Les ORF putatifs du génome ont été annotés à l'aide de Rapid Annotation from the Subsystem Technology (RAST) server44. Pour déterminer la similarité des séquences, tous les ORF prédits ont été analysés à l'aide de BLASTP45. Les domaines fonctionnellement conservés ont été comparés à des protéines connues à l'aide de Pfam-A (ver. 35)46 et de la base de données RCSB PDB47 à HHpred48. Les domaines transmembranaires ont été prédits à l'aide de TMHMM 2.049 et les peptides signaux ont été analysés à l'aide de SignalP (ver. 6.0)50. PhageTerm51 a été réalisé à l'aide du serveur Galaxy pour déterminer les terminaisons de phage et le mécanisme d'emballage. Les génomes des phages SBSEC isolés ont été criblés pour les ARNt en utilisant tRNAscan-SE 2.052. De plus, les gènes de virulence et de résistance aux antibiotiques ont été détectés à l'aide de la base de données des facteurs de virulence des bactéries pathogènes (VFDB)53 et de l'ANNOTation des gènes de résistance aux antibiotiques (ARG-ANNOT)54.

Les cartes génomiques des phages SBSEC isolés ont été visualisées à l'aide du CGView Server55. Un arbre phylogénétique basé sur les génomes disponibles de phages SBSEC isolés avec les souches de la famille Rountreeviridae dans GenBank a été construit à l'aide du système Virus Classification and Tree Building Online Resource56 et de la méthode Genome-BLAST Distance Phylogeny57. La prise en charge des branches de l'arbre a été déduite à l'aide du post-traitement FastME (ver. 2.1.6.1)58 pour les formules D0. Les séquences d'acides aminés codant pour la protéine de capside majeure et l'ADN polymérase ont été alignées à l'aide de Clustal X (ver. 2.1)59 et BioEdit (ver. 7.1.0.3)60 et un arbre phylogénétique unique a été construit en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance (ML) dans MEGA X61. Les valeurs bootstrap ont été calculées pour 100 répétitions. Un diagramme en points des séquences du génome a été généré à l'aide de Gepard 2.1 en utilisant les paramètres par défaut62. OrthoANI63 a été utilisé pour calculer les valeurs moyennes d'identité nucléotidique (ANI) de 30 souches de phages appartenant à la famille Rountreeviridae dans la base de données GenBank. Une carte thermique basée sur les valeurs ANI a été générée à l'aide de la carte thermique du package R (ver. 4.1.2)64. Une analyse comparative des phages SBSEC isolés étroitement liés au phage C1 de Streptococcus a été réalisée à l'aide d'Easyfig65.

L'efficacité des phages SBSEC isolés dans la prévention de la formation de biofilm par la souche hôte a été évaluée comme indiqué précédemment41. Le bouillon TSB additionné de 1 % de saccharose et de 1 % de CaCl2 à une concentration de 0,1 M (TSBs-CaCl2) a été utilisé pour effectuer ces essais car il facilite la formation de biofilm. Les souches hôtes cultivées pendant la nuit (environ 108 UFC/mL) ont été diluées au 1/100 avec du TSBs-CaCl2, et des aliquotes de 100 µL de cette culture diluée ont été mélangées avec du lysat de phage à différentes concentrations (105, 106, 107, 108 et 109 PFU/ mL) en quantités égales. Les mélanges ont été ajoutés à chaque puits d'une plaque stérile à fond plat de 96 puits (SPL Life Sciences, Corée) et incubés à 37 ° C pendant 24 et 48 h. Le TSB sans phage était le témoin négatif. Ensuite, le surnageant sur les plaques a été lavé trois fois avec de l'eau distillée pour éliminer les cellules planctoniques, et les biofilms formés dans chaque puits ont été colorés avec du cristal violet à 0, 1% (CV; Sigma, Royaume-Uni) pendant 20 min à température ambiante. Le CV dans chaque puits a été lavé et dissous dans 100 µL d'éthanol, et la DO a été mesurée à 595 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Spectramax 190, Molecular Devices, USA). Les UFC ont été déterminées à l'aide de dilutions en série d'eau distillée remise en suspension pour compter les cellules bactériennes viables dans le biofilm. L'efficacité des phages SBSEC isolés dans la prévention de la formation de biofilm par les autres souches sensibles aux phages a également été évaluée à l'aide d'une seule concentration de lysat de phage (107 PFU/mL) et les résultats ont été analysés par incubation à 37 ° C pendant 24 h.

La capacité de prévention du biofilm des phages SBSEC isolés a été observée par imagerie à l'aide de CLSM (LSM 800 META, Zeiss, Allemagne). Le biofilm traité avec chaque phage (106 PFU/mL) par rapport au phage non traité a été cultivé dans les lamelles stériles (Marienfeld-Superior, Allemagne) placées dans des plaques à six puits non traitées en surface (SPL life sciences, Corée) à 37 ° C pendant 24 et 48h. Les biofilms formés ont été colorés avec Syto 9 (BacLight, Thermo Fisher, USA) pendant 20 min dans l'obscurité. Les biofilms colorés dans chaque puits ont été montés sur la lame de verre (Marienfeld-Superior, Allemagne). Les comptages de cellules vivantes émettant une fluorescence verte ont été détectés par excitation à 488 nm et émission à 498 nm et visualisés à l'aide d'un objectif 10 × utilisant CLSM.

Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, Californie, États-Unis) pour effectuer des comparaisons à deux groupes à l'aide du test t de Student et des comparaisons multigroupes à l'aide d'une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) avec le test de Tukey. . Le seuil de signification a été fixé à p < 0,05 (*).

Les séquences complètes du génome des phages SBSEC isolés ont été déposées dans GenBank sous les numéros d'accession ON759209 (phage vB_SbRt-pBovineB21) et ON759210 (phage vB_SbRt-pBovineS21). Le phage SBSEC vB_SbRt-pBovineB21 a été déposé au KCCM sous KCCM13031P, et vB_SbRt-pBovineS21 a été déposé au KCTC sous KCTC 4834.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires. Les séquences complètes du génome des phages SBSEC isolés ont été déposées dans GenBank sous les numéros d'accession ON759209 (phage vB_SbRt-pBovineB21) et ON759210 (phage vB_SbRt-pBovineS21).

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Cette recherche a été soutenue par le fonds de recherche de l'Université de Gachon de 2022 (GCU- 202110530001) et par le développement d'une technologie de biomatérialisation des sous-produits de la pêche marine du Korea Institute of Marine Science & Technology Promotion (KIMST) financé par le ministère des Océans et pêche (KIMST-20220128).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Seon Young Park et Hyemin Kwon.

Division des sciences animales et laitières, Collège d'agriculture et des sciences de la vie, Université nationale de Chungnam, Daejeon, 34134, Corée du Sud

Parc Seon Young et Seongwon Seo

Département de microbiologie et de biologie moléculaire, Collège des sciences biologiques et de la biotechnologie, Université nationale de Chungnam, Daejeon, 34134, Corée du Sud

Hyemin Kwon

Laboratoire de biomédecine aquatique, Collège de médecine vétérinaire et Institut de recherche en sciences vétérinaires, Université nationale de Séoul, Séoul, 08826, Corée du Sud

Parc Sang Guen Kim et Se Chang

Department of Food Science and Biotechnology, College of Bionano Technology, Gachon University, Seongnam, 13120, Corée du Sud

Ji Hyung Kim

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SYP, JHK et SS ont conçu l'idée du manuscrit, SGK et SCP ont été impliqués dans les expériences biologiques. SYP, HK et JHK ont préparé les échantillons et effectué des expériences biologiques. SYP et SS étaient principalement responsables de la préparation du manuscrit. HK a effectué l'analyse statistique. SGK, JHK et SCP ont conçu l'étude et aidé à rédiger le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Ji Hyung Kim ou Seongwon Seo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Park, SY, Kwon, H., Kim, SG et al. Caractérisation de deux bactériophages lytiques, infectant le complexe Streptococcus bovis/equinus (SBSEC) de ruminant coréen. Sci Rep 13, 9110 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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Reçu : 17 février 2023

Accepté : 31 mai 2023

Publié: 05 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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