Isolement et caractérisation moléculaire de nouveaux variants de réovirus aviaires et de nouvelles souches en Pennsylvanie, États-Unis, 2011

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 14727 (2015) Citer cet article

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Les infections par le réovirus aviaire (ARV) des troupeaux de poulets de chair et de dindes ont causé d'importantes maladies cliniques et des pertes économiques en Pennsylvanie (PA) depuis 2011. La plupart des oiseaux infectés par les ARV souffraient d'arthrite sévère, de ténosynovite, de péricardite et d'un retard de croissance ou d'un syndrome de retard de croissance. (RSS). Une morbidité élevée (jusqu'à 20% à 40%) a été observée dans les troupeaux affectés par les ARV et la mortalité des troupeaux était parfois aussi élevée que 10%. Des infections ARV chez des dindes ont été diagnostiquées pour la première fois en PA en 2011. De 2011 à 2014, un total de 301 isolements ARV ont été effectués à partir de volailles PA affectées. La caractérisation moléculaire du gène Sigma C de 114 isolats de terrain, représentant la plupart des épidémies d'ARV, a révélé que seulement 21,93 % des 114 isolats d'ARV séquencés se trouvaient dans le même cluster de génotypage (cluster 1) que les souches vaccinales ARV (S1133, 1733 et 2048 ), tandis que 78,07 % des isolats séquencés appartenaient aux groupes de génotypage 2, 3, 4, 5 et 6 (qui étaient distincts des souches vaccinales) et représentaient des variantes d'ARV nouvellement émergentes. En particulier, le groupe de génotypage 6 était un nouveau génotype d'ARV qui a été identifié pour la première fois dans 10 nouvelles variantes d'ARV PA d'isolats de terrain.

Les réovirus aviaires (ARV) sont répandus dans la nature et sont associés à un large éventail de maladies affectant diverses espèces aviaires1,2, y compris les poulets3,4, les faisans5, les dindes6,7, les canards8,9,10, les oies11, les pigeons12, les cailles13,14, 15, rapaces16 et psittacidés17. Cependant, la plupart des maladies cliniques dues aux infections ARV sont observées chez les poulets de chair et les poulets reproducteurs18. Chez les jeunes poulets de chair, les syndromes cliniques les plus fréquents sont la ténosynovite, le syndrome de malabsorption, le syndrome de rabougrissement (RSS), les problèmes de maladies entériques et l'immunosuppression19,20,21,22,23. Les infections ARV chez les volailles domestiques ont plusieurs effets économiquement significatifs. Ceux-ci incluent une mortalité accrue, un manque général de performance, une diminution du gain de poids, une faible conversion alimentaire, un taux de croissance inégal, une commercialisation réduite des oiseaux affectés, une arthrite virale/ténosynovite et des infections secondaires par d'autres virus ou bactéries2,22.

Les ARV appartiennent au genre Orthoreovirus de la famille des Reoviridae24,25. Ils contiennent 10 segments génomiques d'ARN double brin (dsRNA), dont les classes de taille 3 L (grande), 3 M (moyenne) et 4 S (petite) en fonction de la mobilité électrophorétique des segments26. Les résultats de la recherche ont révélé que la protéine sigma C codée par le segment du génome S1 est la protéine d'attachement cellulaire et un déterminant antigénique majeur pour les ARV ; le segment S1 du génome des souches ARV de poulet existantes est bien caractérisé et bien conservé dans les virus de poulet27,28,29,30. Les souches d'ARV d'origine dinde circulant dans le Midwest américain ces dernières années sont antigéniquement distinctes des souches d'ARV d'origine poulet. Les souches d'ARV d'origine dinde sont considérées comme un sous-type de virus distinct au sein du genre Orthoreovirus31,32,33.

De nouvelles infections ARV émergentes se sont produites en Pennsylvanie (PA), aux États-Unis, depuis 2011 et ont depuis causé des maladies et des pertes économiques majeures dans l'industrie avicole de l'AP. Une estimation prudente des coûts de ces infections ARV chez les poulets à griller est de 23 000 $/par troupeau affecté (28 000 oiseaux/troupeau) et une entreprise de dinde a estimé les pertes à 3 millions de dollars en un an. La vaccination contre les ARV avec des vaccins conventionnels avant les épidémies observées avait été pratiquée chez les reproducteurs pondeuses et poulets de chair. Cependant, ces vaccins conventionnels ne semblaient conférer aucune protection contre les infections ARV de terrain. Jusqu'à cette époque, les troupeaux reproducteurs de dindons n'avaient pas reçu de vaccins ARV. Aucune vaccination ARV n'avait été pratiquée dans les troupeaux commerciaux de pondeuses, de poulets de chair ou de dindes. Depuis la détection de variantes d'infections ARV dans les troupeaux commerciaux de dindes et de poulets de chair, l'industrie avicole a eu recours à la vaccination des troupeaux reproducteurs avec des vaccins ARV autogènes tués.

Les infections ARV chez les poulets de chair et les dindes sont de plus en plus diagnostiquées en AP depuis 2011 et continuent d'être observées. Entre 2011 et 2014, 301 cas (troupeaux) ont été confirmés comme étant des infections ARV par isolement du virus dans notre laboratoire. La plupart des cas positifs aux ARV concernaient des poulets de chair et des dindes malades souffrant d'arthrite/ténosynovite sévère, impliquant de multiples articulations et tendons des pattes, y compris le grasset, le jarret et les coussinets plantaires, avec une inflammation s'étendant à la musculature environnante. Une morbidité élevée (20 à 40 %) et une mortalité (jusqu'à 10 %) étaient souvent présentes. Cet article décrit nos résultats de diagnostic et de recherche dans l'isolement et la caractérisation moléculaire de ces variantes d'ARV de PA, USA.

Les infections ARV ont causé des maladies cliniques importantes et des pertes économiques chez les volailles PA depuis 2011, en particulier chez les poulets à griller et les dindes. Des infections ARV chez des dindes ont été diagnostiquées pour la première fois en PA en juin 2011 (Tableau 1, #54 : Reo/PA/Turkey/12883/11). Les troupeaux de poulets de chair et de dindes infectés par les ARV souffrent de boiteries sévères et de jambes écartées dues à une ténosynovite couvrant les articulations fémorotibiotarsiennes et intertarsiennes et la région métatarsienne plantaire et, dans certains cas, une inflammation s'étendant à la musculature environnante (Fig. 1a, b). L'apparition de la maladie s'est généralement produite entre 2 et 4 semaines d'âge dans les troupeaux de poulets de chair et à 10 semaines ou plus dans les troupeaux de dindes. Une morbidité élevée (jusqu'à 20% à 40%) des oiseaux infectés par les ARV dans un troupeau a été couramment observée et la mortalité dans les cas les plus graves était jusqu'à 10%. La présence de lésions pathologiques macroscopiques majeures comprenait un gonflement marqué, un œdème, des hémorragies dans les tendons et les gaines tendineuses et, dans les cas plus chroniques, une rupture tendineuse de pleine épaisseur avec hémorragie sévère (Fig. 1c, d). Des lésions de péricardite étaient également présentes chez certains oiseaux affectés (Fig. 1e). Au microscope, les types de cellules inflammatoires prédominants dans les tissus affectés étaient les lymphocytes et les plasmocytes (Fig. 1f).

Au total, 301 isolats de terrain ARV ont été obtenus dans notre laboratoire de 2011 à 2014, principalement à partir de tendons et certains d'autres tissus (cœurs, foies ou intestins) d'oiseaux infectés par ARV. Les isolements de virus ont été réalisés dans des cultures de cellules monocouches LMH (ATCC CRL-2113) (Figs 2, 1a). Sur les 301 isolats de terrain ARV, 206 provenaient de poulets de chair, 18 de poules pondeuses, 63 de dindes, 7 de perdrix chukar, 4 de pintades, 2 de faisans à collier et 1 de colin de Virginie (tableau complémentaire 1). Des effets cytopathiques géants ou "bloom-like" (CPE) étaient caractéristiques des infections ARV dans les cultures de cellules LMH (Figs 2, 1b – d). Tous les 301 isolats d'ARV ont été confirmés par des cellules géantes ou "bloom-like" CPE-positives, qui ont ensuite été colorées positives pour l'ARV par le test d'anticorps fluorescent (FA) utilisant un anticorps ARV fluorescent (Fig. 2b – d). Les périodes d'incubation pour le CPE variaient : le premier CPE a été observé 24 heures après l'inoculation (pi) ; la dernière a été observée, dans quelques cas, après 4 passages cellulaires en série ; et pour la plupart des cas positifs aux ARV, un CPE a été observé 3 à 5 jours pi, dans les 2 à 3 passages cellulaires en série.

Au total, 114 isolats de terrain d'ARV représentant des cas d'ARV chez le poulet de chair, la pondeuse, la dinde, le faisan et la pintade diagnostiqués entre 2011 et 2014 ont été sélectionnés pour la caractérisation moléculaire du segment S1 du gène σC (tableau 1). Chacun des 114 isolats d'ARV a été amplifié avec succès sous la forme d'un fragment de 1088 pb par RT-PCR basée sur S1 en utilisant des amorces P1/P434. Le produit de PCR a ensuite été purifié et soumis au Penn State Genomics Core Facility pour le séquençage du gène S1.

La construction d'arbres phylogénétiques et l'analyse pour la conservation des séquences du segment S1 du gène σC des 114 souches de terrain ARV (tableau 1) avec 28 autres séquences de souches de référence (tableau supplémentaire 2) extraites de GenBank ont révélé que les 114 souches de terrain ARV isolées de la volaille PA ont été regroupés en 6 clusters de génotypage, ou génotypes (Fig. 3). Sur les 114 souches sauvages de ces clusters, 25 (21,93%) étaient dans le même cluster (cluster 1) que les souches vaccinales ARV standard (S1133, 1733, 2048) ; 38 (33,33 %) dans le groupe 2 ; 7 (6,14 %) dans les groupes 3 et 4 ; 27 (23,68 %) dans le groupe 5 ; et 10 (8,77 %) dans le groupe 6 (Tableau 2 ; Fig. 3). En particulier, le groupe de génotypage 6, ou génotype 6, a été identifié pour la première fois dans 10 souches de terrain d'ARV détectées chez des volailles PA et ces souches étaient nouvelles et distinctes de toutes les souches de référence d'ARV précédemment publiées.

Arbres phylogénétiques montrant 6 grappes de génotypage (6 couleurs codées) des 114 souches de terrain de réovirus aviaire (ARV) isolées en Pennsylvanie aux États-Unis, 2011-2014.

L'analyse était basée sur 300 séquences d'acides aminés de séquences de gènes σC. Les longueurs des branches sont proportionnelles aux distances évolutives entre les séquences. Les échelles représentent les substitutions de nucléotides par position. Les noms des 28 souches de référence ARV extraites de GenBank se trouvent uniquement dans les groupes 1 à 5 (en gras pour les distinguer des souches de terrain).

Une comparaison par paires de la prédiction de la séquence d'acides aminés (aa) (1 à 300) a été réalisée pour examiner le degré d'identité de séquence des homologues des gènes σC entre les 114 souches de terrain ARV PA et les 28 souches de référence ARV extraites de GenBank (Fig. 3). En général, les identités de séquence aa des gènes codant pour σC se sont révélées varier considérablement (de 40 % à 100 %) parmi les souches de terrain ARV 114 PA ; les similitudes aa étaient inférieures à 60,8 % entre 2 des 6 groupes de génotypage ; divers degrés de différences entre les similitudes aa au sein de chaque groupe ont été observés.

La classification des clusters et sous-clusters de génotypage ARV a été basée sur les valeurs bootstrap (analyse réalisée avec 1000 pseudo-réplicats). Lorsque les 114 souches de terrain et les 28 souches de référence ont été tracées ensemble pour construire des arbres phylogénétiques (arbre circulaire ou arbre linéaire), l'arbre circulaire (Fig. 3) était meilleur que l'arbre linéaire pour illustrer clairement les grappes et les sous-grappes.

Dans le groupe de génotypage 1 (Fig. 3), les 25 souches de terrain PA ARV partageaient une identité de séquence élevée (71,0–100 %) et elles étaient divisées en 3 sous-groupes différents : le sous-groupe 1 était formé de 16 souches de poulets de chair PA, partageant 98,4 à 100 % d'identité. Le sous-groupe 2 était formé de 5 souches de poulets de chair et de 3 souches de pondeuses, partageant 80,6 à 97,6 % d'identité aa. Les 11 souches de référence d'ARV, y compris les souches vaccinales standard extraites de GenBank et la souche de poulet de chair PA restante, ont formé le sous-groupe 3. Les souches de référence ARV et 72,1–75,4% d'identités aa avec la souche de poulet de chair ARV 1 PA dans le sous-groupe 3.

Dans le groupe de génotypage 2, les 38 souches de terrain PA ARV partageaient une large gamme (58,8 à 100 %) d'identité de séquence aa et formaient 3 sous-groupes différents. Le sous-groupe 1 était formé de quelques souches d'origine poulet mais comprenait 15 souches de dinde, 2 souches de perdrix chukar, 2 souches de poulet de chair et 1 souche de pintade et ils partageaient 90,8 à 100% d'identité aa. Le sous-groupe 2 comprenait 11 souches de poulets de chair et 1 souche de pintade et ils partageaient 78,6 à 99,1 % d'identité aa. Le sous-groupe 3 comprenait 5 souches de poulets de chair, 1 souche pondeuse et 3 souches de référence et ils partageaient 66,0 à 100 % d'identité aa.

Dans le groupe de génotypage 3, 4 des 5 souches de poulets de chair (sauf Reo/Broiler/PA/28439/11) et 2 souches pondeuses ne partageaient que 77,8 à 80,5 % d'identité aa avec les 4 souches de référence GenBank. Dans le groupe 4, toutes les 7 souches de terrain PA ARV provenaient de poulets de chair et 6 des 7 partageaient une identité élevée (93,1–99,1 %) ; la souche restante (Reo/PA/Broiler/05682/12) présentait une forte similarité avec la souche AVS-B. Le groupe 5 comprenait 27 souches de terrain ARV PA, dont 23 souches de poulet de chair, 2 souches pondeuses, 1 souche de dinde et 1 souche de faisan à collier, avec une identité de séquence aa élevée entre elles (85,2 à 100 %) et elles étaient modérément liées à les 5 souches de référence (59,8–80,8 %) dans ce cluster.

Un nouveau cluster de génotypage, le cluster 6, a été identifié pour la première fois dans cette étude. Les 10 nouvelles souches de terrain PA ARV, dont 9 souches de poulet de chair et 1 souche de dinde, ont construit le nouveau groupe de génotypage 6, qui était distinct des groupes 1 à 5. L'identité aa partagée était de 71,0 à 99,9 % dans le groupe 6 mais de 42,6 à 60,1 % dans les 5 autres clusters.

Les séquences de gènes σC de 114 souches de terrain ARV caractérisées par des grappes de génotypage σC, représentant les génotypes 1 à 6 détectés chez la volaille PA aux États-Unis, ont été déposées dans GenBank en octobre (5 de KM #s) de 2014, janvier (51 de KP # s) et mai (58 des numéros KR) de 2015 (tableau 1).

Les tendons et les tissus synoviaux étaient les spécimens préférés pour l'isolement des ARV chez les oiseaux présentant des signes cliniques et des lésions compatibles avec ceux de l'infection par les ARV1,2,35. D'autres tissus, y compris le cœur, le foie et l'intestin, ont également été prélevés dans certains cas lorsque des lésions de péricardite ont été observées ou lorsque des signes cliniques de croissance médiocre, de malabsorption ou de mauvaise digestion étaient présents. L'autopsie et la collecte d'échantillons ont été effectuées dans l'installation d'autopsie du Laboratoire de diagnostic animal de l'Université d'État de Pennsylvanie, conformément aux directives approuvées par le Département de l'agriculture des États-Unis (USDA). (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf).

Chaque échantillon de tissu collecté a été haché avec des ciseaux stériles dans un récipient en plastique stérile de 20 ml (n° de catalogue 14310-684, www.vwr.com) et dilué avec un milieu de transport viral à une dilution de 1:5 (p/v). Le mélange a ensuite été placé dans un sac Stomacher et homogénéisé dans un mélangeur Stomacher (modèle 80, Seward, Ltd., Royaume-Uni) pendant 2 à 3 minutes. Ensuite, l'homogénat de tissu a été transféré dans un tube conique en polypropylène stérile de 15 ml et centrifugé à 1200 tr/min pendant 10 min à 5 °C. Enfin, le surnageant a été collecté et filtré à travers un filtre à seringue de 0,45 nm pour être prêt pour l'inoculation cellulaire pour l'isolement des ARV.

LMH (ATCC CRL-2113) est une lignée cellulaire épithéliale de carcinome hépatocellulaire primaire développée à partir de la transformation chimique de nodules tumoraux dans le foie d'un poulet leghorn mâle par un traitement à long terme avec de la diéthylnitrosamine36. La lignée cellulaire LMH a un phénotype épithélial et une morphologie dendritique. Les cellules LMH sont très sensibles aux ARV, adénovirus aviaires, birnavirus, rotavirus, poxvirus et autres virus aviaires testés dans nos études de recherche en cours. Les cellules LMH sont cultivées régulièrement dans notre laboratoire de virologie aviaire dans le but d'isoler les virus aviaires pour diagnostiquer l'infection.

Une préparation de milieu de croissance cellulaire LMH consiste en 500 ml de DMEM/F-12 50/50 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix, 1X) avec L-glutamine et 15 mM HEPES (Corning Cellgro, Réf. No. 10-092-CV, USA), 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 5 ml de PSA (Pen-Step-Amp) (Cellgro, Ref No. 30-004-CI) et 2,5 ml de sulfate de gentamicine (10mg/ml). La composition du milieu de maintenance cellulaire LMH est la même que celle du milieu de croissance, sauf qu'il ne contient que 2 % (ou 10 ml) de FBS. Les procédures de culture cellulaire LMH sont, brièvement, comme suit : (1) Un flacon de cellules LMH de stock (1 ml préparé par flacon T-25 cm2, au moins 1 × 106/cellules viables) a été prélevé dans un réservoir d'azote liquide, placé dans un bain-marie à 37 °C pour une décongélation rapide puis centrifugé à 1000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C ; le surnageant a été jeté. Alternativement, un flacon de culture cellulaire LMH en cours a été traité pour la sous-culture à un rapport de 1: 4 à 1: 6 par procédure de culture cellulaire de routine37 ; (2) Le culot cellulaire a été remis en suspension avec 1 ml de milieu de croissance préchauffé et dilué dans un rapport de 1:20 (c'est-à-dire 1 ml de suspension cellulaire, 19 ml de milieu de croissance) pour les sous-cultures de cellules LMH ; (3) La suspension cellulaire dépendait des flacons (par exemple, 2,5 ml par flacon T-12,5 cm2, 5 ml par flacon T-25 cm2, 1,5 à 2 ml par puits sur une plaque de culture cellulaire à 6 puits, ou 1 ml par puits sur une plaque de 12 puits, qui ont été couramment utilisés à des fins de diagnostic de l'isolement du virus aviaire dans notre laboratoire) ; (4) Les flacons ensemencés de cellules LMH ont été placés dans un incubateur réglé à 37 ° C avec 5% de CO2. Une monocouche confluente s'est formée en 48 à 72 heures, en fonction de la densité d'ensemencement des cellules. Lorsqu'une monocouche de 75 % ou plus de confluence s'est formée, les flacons de cellules LMH étaient prêts à l'emploi pour l'inoculation d'échantillons pour l'isolement du virus aviaire. Les flacons de cellules LMH non inoculées ont servi de sous-cultures continues de lignées cellulaires jusqu'à 50 ou 100 passages. Un flacon de cellules de semence pouvait être maintenu pendant 1 à 2 semaines et le rapport de sous-culture était de 1: 4 à 1: 8, comme pour les procédures de sous-culture cellulaire standard37.

Des flacons T12,5 cm2 et des plaques à 12 ou 24 puits de cultures de cellules LMH monocouches ont été principalement utilisés pour les isolements d'ARV ou d'autres virus aviaires dans notre laboratoire. Le milieu de croissance LMH a été retiré des flacons de culture cellulaire, qui ont ensuite été rincés avec du PBS stérile (8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,15 g de NaH2PO4, 0,2 g de KH2PO4, 1000 ml de d-H2O) pour éliminer le FBS résiduel des cellules. Les flacons ont été inoculés avec 0,25 ml (pour les flacons T12,5) ou 0,5 ml (pour les flacons T25) de surnageant de chaque préparation d'échantillon. Un flacon de cellules de contrôle négatif a été inoculé avec du VTM. Les flacons de cellules inoculés ont été incubés dans un incubateur à 37 ° C pour l'adsorption de l'inoculum pendant 20 à 30 minutes. Le milieu de maintenance LMH (2,5 à 3,0 ml pour un flacon T12,5, 2,0 ml/par puits pour une plaque à 12 puits, 1 ml/par puits pour une plaque à 24 puits) a été ajouté aux flacons et incubé à 37 °C moins de 5% de CO2. Les monocouches inoculées avec des échantillons ont été examinées quotidiennement pendant une période de 5 à 7 jours pour le développement d'effets cytopathiques viraux (CPE). Deux à trois passages cellulaires en série ont été effectués en routine pour chaque échantillon afin de confirmer les résultats négatifs. Les CPE positifs par ARV ou d'autres infections virales entériques aviaires courantes (par exemple, adénovirus, rotavirus, herpèsvirus et birnavirus) ont généralement été déterminés en 1 à 3 passages cellulaires.

De nouvelles procédures développées par nous, impliquant la coloration FA des cellules CPE précoces, ont été couramment utilisées pour la détection précoce des ARV dans cette étude. En bref, ces procédures comprenaient les étapes suivantes : (1) Un échantillon de 1 ml de liquide de culture cellulaire contenant des cellules CPE virales (sans interruption des cultures cellulaires) a été prélevé dans un flacon de culture cellulaire inoculé avec un échantillon lorsque les cellules ont été observées en train de subir une CPE. et être libéré dans le milieu à partir de la monocouche ; (2) L'échantillon de fluide de culture cellulaire a été centrifugé à 900 tr/min pour centrifuger les cellules CPE ; (3) Le surnageant du milieu a été retransféré dans le flacon d'origine (qui a continué à être cultivé) et les cellules CPE ont été remises en suspension dans du PBS dans un rapport d'environ 1:5 ; (4) Les cellules CPE remises en suspension ont été placées sur une lame de verre de microscope de 25 × 75 × 1 mm (Globe Scientific, Inc., New Jersey, États-Unis), avec 0,1 à 0,2 ml de PBS (ou 1 à 2 gouttes) par échantillon et une forme ronde de 10 à 12 mm de diamètre pour le séchage à l'air; (5) La lame a été fixée avec de l'acétone froide (-20 ° C) pendant 10 min et la zone de l'échantillon a été encerclée avec un stylo à encre ou un crayon diamant; (6) Les cellules CPE ont été colorées avec un anticorps anti-ARV marqué par fluorescence (ID No. 680 VDL 9501, NVSL, Ames, IA, USA) et la lame a été placée dans une chambre humide dans un incubateur à 37 °C pendant 30– 40 min dans l'obscurité; (7) L'anticorps fluorescent a été éliminé en rinçant doucement d'une extrémité de la lame (ne délogant ainsi pas les cellules) avec du PBS et la lame a ensuite été inondée de PBS pendant 2 à 3 min pour chacun des 3 lavages au total ; ensuite, la lame a été placée face vers le haut sur une serviette en papier pour lui permettre de sécher à l'air (ou la lame a été placée dans un porte-lame et placée dans un bocal en verre avec une barre d'agitation au fond, le bocal en verre a été rempli de PBS jusqu'à ce que les lames ont été recouvertes et le bocal à lames a été placé sur une plaque d'agitation ajustée à une vitesse d'agitation douce pendant 8 à 10 min pour terminer le lavage) ; (8) La lame a été montée avec un milieu de montage (50 % de tampon PBS, 50 % de glycérol, pH 8,4) et la région colorée a été placée sous une lamelle pour un examen ultérieur. La lame a été conservée à température ambiante si la visualisation devait avoir lieu dans les 1 ou 2 heures et a été sinon stockée dans un réfrigérateur pour une visualisation dans les 24 heures. Les cellules CPE qui étaient positives pour l'ARV étaient colorées en vert pomme.

Les procédures traditionnelles d'isolement du virus dans les cultures cellulaires nécessitent une quantité importante de développement de CPE (> 50 à 70 %) et l'arrêt de la culture cellulaire pour effectuer des tests d'identification de virus ultérieurs afin de confirmer un isolat positif. En utilisant nos nouvelles procédures, en particulier pour l'isolement des ARV dans ce projet, un isolement précoce du virus a été réalisé pour la plupart des cas positifs aux ARV. Étant donné que seul un petit nombre de cellules CPE précoces (aussi peu que 5 à 10) étaient nécessaires pour la confirmation ARV-positive par coloration FA, nos résultats d'isolement de virus pour le diagnostic ARV ont été obtenus 2 à 3 jours plus tôt (en moyenne) que le moment de développant au-dessus de 50 à 70 % de CPE pour la terminaison des plaques de culture cellulaire.

L'ARN viral a été extrait du surnageant de culture cellulaire à l'aide d'un kit RNeasy Mini (Cat. No. 74106, QIAGEN, Valencia, CA), en suivant les instructions du fabricant. L'ARN extrait a été utilisé comme matrice pour amplifier un fragment de 1088 pb d'un segment ARV S1 en utilisant les amorces publiées P1/P434. Le test RT-PCR a été réalisé dans un mélange réactionnel de 50 μl à l'aide d'un kit One Step RT-PCR (Cat. No. 210212, QIAGEN, Valencia, CA) contenant 10 μl d'ARN matrice, 25 μl d'eau sans RNase, 10 μl de tampon 5 ×, 2 μl de mélange de dNTP (10 mM chaque dNTP), 1 μl de mélange d'enzymes et 1 μl de chacune des deux amorces. L'amplification a été réalisée avec le thermocycleur Applied Biosystems 9700 en utilisant une étape de transcription inverse à 50 ° C pendant 30 min. L'étape d'activation PCR initiale a été fixée à 95 ° C pendant 15 min; puis a été suivi de 94 ° C pendant 30 s, 50 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 90 s de chaque cycle pendant 38 cycles ; et enfin complété par un seul cycle de 72 °C pendant 5 min.

Les produits de RT-PCR du segment ARV S1 ont été isolés et visualisés dans un gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium. Les bandes spécifiques de 1088 pb ont été excisées et chargées sur les colonnes de centrifugation d'un kit d'extraction de gel (lot n° 04113KE1, Axygen, Tewksbury, MA) en utilisant une simple procédure de liaison/lavage/élution. Le produit de PCR purifié a été mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop™ 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA) et dilué à 40 ng/μl pour être utilisé comme matrices de séquençage. Tous les échantillons et les amorces P1/P4 (1 μM) ont été soumis au Penn State Genomics Core Facility pour le séquençage Sanger à l'aide de l'analyseur d'ADN 3730XL (Applied Biosystems, Grand Island, NY).

Nous avons utilisé des méthodes de jonction de voisins pour l'analyse phylogénétique dans cette étude. La suite Lasergene 12 Core (DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA) a été utilisée pour l'assemblage des données de séquençage Sanger, la prédiction ORF et la traduction des séquences nucléotidiques. Des recherches BLASTN ont été utilisées pour étudier les similitudes de séquence entre les souches de terrain ARV et les souches de référence dans GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Une analyse phylogénétique a été réalisée sur le segment S1 (nucléotides 525-1424) du gène σC (900 bases). Les alignements de séquences ont été réalisés à l'aide du programme ClustalW 1.83 (http://align.genome.jp). Des arbres de jonction de voisins et de maximum de vraisemblance (ML) ont été générés et les topologies d'arbres ont été validées par une analyse bootstrap telle qu'implémentée dans le programme MEGA (version 5.0) avec des distances absolues après 1000 répliques bootstrap38.

Les méthodes de diagnostic clinique et d'autopsie ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le Département de l'agriculture des États-Unis (USDA). (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf). Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par The Pennsylvania State University, The Office for Research Protections.

Bien que l'isolement du virus prenne du temps, il est toujours préféré en virologie diagnostique et est d'une importance cruciale pour la découverte de nouveaux virus ou de nouvelles souches ou variantes de terrain émergentes. Dans cette étude, nos procédures nouvellement modifiées pour la détection précoce du virus dans les cultures cellulaires ont été utilisées efficacement pour le diagnostic précoce des cas d'ARV. Dès qu'un petit nombre de cellules CPE ont été observées dans des cultures cellulaires inoculées avec des échantillons, un échantillon des cellules CPE a été prélevé pour la coloration ARV FA afin de confirmer les résultats de l'isolement du virus sans mettre fin aux cultures cellulaires. Cela a permis un diagnostic plus précoce que les procédures traditionnelles d'isolement du virus, qui nécessitent d'attendre jusqu'à 50 à 70% de développement du CPE. En moyenne, le virus a été isolé 2 à 3 jours plus tôt pour la plupart des cas d'ARV en utilisant la nouvelle procédure. De plus, la nouvelle procédure fournit des résultats clairs grâce à l'utilisation de cellules CPE concentrées et permet la détection simultanée de virus suspects supplémentaires en préparant des lames en double.

σC est la protéine la plus variable dans ARV39. Il médie la fixation du virus aux cellules cibles et les anticorps spécifiques de σC neutralisent les infections ARV40,41. Dans cette étude, nos résultats de recherche issus de l'analyse phylogénétique des séquences du gène σC ont révélé que les 114 souches de terrain d'ARV étaient génétiquement différentes et regroupées en 6 groupes de génotypage, ou génotypes (Fig. 3) ; 90 des 114 isolats, dans les groupes 2 à 6, étaient des variants de terrain et distincts des souches vaccinales ARV standard (S1133, 1733, 2408), qui sont regroupées dans le groupe 1. Plus important encore, un nouveau groupe de génotypage (groupe 6) a été identifié dans cette étude pour la première fois. Les 10 nouvelles souches de terrain ARV détectées dans la volaille PA (9 provenant de poulets à griller, 1 de dindes) ont formé le nouveau groupe de génotypage ARV 6 et les souches présentaient une grande diversité génétique (jusqu'à 30 % de différence les unes par rapport aux autres).

Dans le groupe de génotypage 1, 24 des 25 souches de terrain ARV PA ont formé des sous-groupes distincts montrant des différences par rapport au sous-groupe de souches vaccinales ARV et la faible identité aa (70,6–88,8 %) entre ces sous-groupes indique que les 24 souches ARV PA les souches de terrain ne sont pas identiques aux souches vaccinales ou sont peut-être des variants de terrain liés au vaccin. De même, des variations d'identité aa entre sous-clusters ont également été observées dans les clusters de génotypage 2, 3, 4 et 5, dans lesquels la majorité des souches de terrain PA ARV formaient leurs propres sous-clusters, les distinguant des souches de référence ARV détectées par ailleurs ( Pays-Bas, Allemagne, États-Unis et Taïwan) (Fig. 3 ; S Tableau 2). Néanmoins, le nouveau groupe de génotypage 6 et les souches ou variantes de terrain nouvellement émergentes dans les groupes 1 à 5 indiquent que des mutations ou des recombinaisons révolutionnaires d'ARV se sont produites ou se produisent continuellement, ce qui peut continuer à produire des variantes de terrain ARV supplémentaires ou de nouvelles souches.

Dans le groupe de génotypage 2, le sous-groupe 1 comprenait 15 souches de dinde, 2 souches de chukar, 2 souches de poulet de chair et 1 souche de pintade détectées dans PA. Ces souches de terrain d'ARV PA avaient une homologie nucléotidique allant de 90,8 % à 100 % entre elles et de 92,3 % à 99,8 % avec les souches d'ARV de dinde 3 MN survenues en 201133, ce qui suggère que ces souches d'ARV PA étaient probablement transmises du Midwest souches d'origine dinde.

Étant donné que chaque souche d'ARV contient 10 segments génomiques de classes de taille 3 L (grande), 3 M (moyenne) et 4 S (petite)26, les caractérisations complètes du séquençage du génome peuvent fournir des informations plus détaillées sur le génome des souches d'ARV d'intérêt. En utilisant des procédures traditionnelles de séquençage du génome42, nous avons effectué une caractérisation génomique complète de la souche de terrain ARV de poulet de chair PA (Reo/PA/Broiler/05682/12)43. Nos résultats de séquençage du génome de cet ARV pour poulet de chair ont révélé que la plus grande similitude de séquence a été observée avec la souche AVS-B classique dans le segment S1 du gène σC. La souche de terrain ARV de poulet de chair n'était que modérément similaire aux segments M2 et M3 de la souche AVS-B et la plus faible similarité de séquence est apparue dans la séquence la plus en 5' du segment du génome M2.

Nous menons actuellement des études de caractérisation du séquençage complet du génome sur les nouveaux variants d'ARV et les nouvelles souches en utilisant le système Illumina MiSeq de séquençage de nouvelle génération (NGS)44, qui nous permet de déterminer les emplacements des gènes mutés dans les séquences complètes des 10 génomes. segments. Les découvertes scientifiques récentes résultant de l'application des technologies NGS mettent en évidence l'intérêt frappant d'utiliser des plates-formes massivement parallèles pour les analyses génétiques45,46,47,48,49. Ces nouvelles méthodes ont élargi les lectures précédemment ciblées d'une variété de protocoles de préparation d'ADN à l'échelle du génome et ont affiné la résolution de ces lectures à une précision de base unique. Le séquençage de l'ARN a également progressé et comprend désormais des analyses d'ADNc pleine longueur, une analyse en série de méthodes basées sur l'expression génique et la découverte d'ARN non codant. Par conséquent, l'application des méthodologies NGS pour poursuivre cette recherche sur les ARV fournira des informations complètes sur la séquence génomique des nouvelles variantes de champ ARV émergentes et des nouvelles souches et nous permettra de mieux comprendre comment ces nouvelles souches ont réalisé des changements génomiques révolutionnaires.

L'approche de contrôle la plus critique pour limiter la maladie clinique associée aux infections ARV consiste à vacciner les reproducteurs de manière appropriée avec des vaccins efficaces, réduisant ainsi le potentiel de transmission verticale et fournissant à la progéniture des anticorps maternels spécifiques qui protègent contre les souches de terrain actuelles. En plus de la caractérisation du séquençage du segment S1 du gène σC rapportée dans cette étude, la caractérisation complète du génome des nouvelles souches de terrain ARV émergentes fournira des données scientifiques plus détaillées, nous permettant de mieux comprendre les mutations ARV, les recombinaisons et les caractéristiques d'épidémiologie moléculaire associées. Ces études aideront à développer des vaccins autogènes efficaces à virus tué et à virus vivant et d'autres stratégies de protection.

Comment citer cet article : Lu, H. et al. Isolement et caractérisation moléculaire des nouveaux variants de réovirus aviaires et des nouvelles souches en Pennsylvanie, États-Unis, 2011-2014. Sci. Rep. 5, 14727; doi : 10.1038/srep14727 (2015).

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Ces études de diagnostic et de recherche sur les réovirus aviaires ont été financées par le programme de recherche de la Commission de santé animale et de diagnostic (AHDC) du ministère de l'Agriculture de Pennsylvanie (PDA), 2013-2015, Pennsylvanie, États-Unis ; Programme de recherche sur le contrôle des poulets de chair et des œufs de Pennsylvanie Poultry Industry et programme de recherche du Pennsylvania Soybean Board, 2015, Pennsylvanie, États-Unis.

Laboratoire de diagnostic animal, Département des sciences vétérinaires et biomédicales, Université d'État de Pennsylvanie, University Park, 16802, PA

Huaguang Lu, Yi Tang, Patricia A. Dunn, Eva A. Wallner-Pendleton, Lin Lin et Eric A. Knoll

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HL a rédigé le texte principal du manuscrit, préparé les tableaux (1, 2, S1, S2) et les figures (1a, 1b et 2), supervisé le projet et participé à l'isolement des virus et aux études moléculaires. YT a réalisé les études de caractérisation moléculaire et l'analyse des données de séquençage, préparé la figure 3 et assisté les tableaux 1, 2 et S2. PAD et EAW ont effectué des enquêtes sur le terrain, des diagnostics cliniques et pathologiques et des collectes d'échantillons et ont préparé la figure 1 (c – f). LL a effectué des cultures de cellules LMH, des isolements de virus et un test FA et un test moléculaire assisté, tableau S1 et figure 2. EAK a effectué le traitement des échantillons et l'isolement du virus assisté et le tableau S1. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Signes cliniques et lésions pathologiques des infections à réovirus aviaires chez les poulets de chair.

(a) Cas de poulets de chair atteints de ténosynovite sévère à l'âge de 4 semaines ; (b) Ténosynovite associée à la jambe entière ; (c) Gonflement, œdème et hémorragies dans les tendons et les gaines tendineuses ; (d) Rupture du tendon de pleine épaisseur ; (e) Lésions de péricardite; ( f ) Lésions au microscope de ténosynovite lymphocytaire plasmacytaire chronique sur une coupe transversale du tendon, de la synoviale et des tissus associés près de l'articulation intertarsienne.

Détection du réovirus aviaire (ARV) par test d'anticorps fluorescents (FA) sur des cellules à effet cytopathique (CPE) infectées par le réovirus.

(1a) Contrôle négatif des cultures de cellules normales LMH ; (2a), (3a) et (4a) Cellules CPE géantes ou "bloom-like" caractéristiques des infections ARV dans des cultures de cellules LMH ; (1b) test FA négatif sur cellules LMH normales ; (2b), (3b) et (4b) tests FA positifs sur des cellules CPE infectées par ARV. Remarque: La feuille de cellules LMH non infectées colorées par FA (1b) et les feuilles de cellules infectées par ARV (2b, 3b, 4b) ont été récoltées à partir des cultures de cellules LMH correspondantes (1a, 2a, 3a, 4a) dans environ 1 ml de milieu de culture et puis préparé sur des lames de verre pour le test FA.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Com-mons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Lu, H., Tang, Y., Dunn, P. et al. Isolement et caractérisation moléculaire des nouveaux variants de réovirus aviaires et des nouvelles souches en Pennsylvanie, États-Unis, 2011-2014. Sci Rep 5, 14727 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14727

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Reçu : 02 avril 2015

Accepté : 07 septembre 2015

Publié: 15 octobre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep14727

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